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研究背景肌腱病(tendinopathy)是骨科学、运动医学和职业病医学的常见病之一。普遍认为肌腱病与肌腱的过度使用(overuse)直接有关,但其发病机制尚不明确。肌腱病发病机制目前主要存在两种截然相反的观点:炎症介质学说和肌腱退变学说。支持炎症介质学说的学者认为肌腱在过度使用后首先产生炎症介质,炎症介质导致肌腱组织变性,从而引起肌腱病;而支持肌腱退变学说的学者持反对意见,认为肌腱病中无炎症介质参与,肌腱病是由肌腱退行性病变引起。本研究拟探讨肌腱细胞在过度牵伸载荷下是否产生炎症介质。由于体内环境的复杂性及伦理学相关问题,直接在体内观察肌腱组织细胞对机械应力刺激的反应及其机理比较困难,主要依赖体外细胞牵拉装置机械牵拉体外肌腱细胞以研究肌腱细胞在过度牵拉下是否有炎症介质产生。但目前体外细胞牵拉装置存在以下不足:1.对牵拉的强度及频率控制范围窄,自动化程度低,需要人工调节;2.应力的施加模式单一,对所有需要牵拉的细胞实行单一牵拉模式,不能有效的反应不同细胞在不同牵拉情况下的反应;3.不能较好的模拟体内细胞排列方向及受力方式进行牵拉,影响研究结果。研究目的根据体内肌腱细胞排列方向及受力方式,研制一种新型肌腱细胞循环牵伸载荷系统,建立体外肌腱细胞过度牵拉模型并予以测试。通过测定过度牵拉负荷下人肌腱细胞产生的炎性介质:前列腺素E2(PGE2)、白介素1β(IL-1β)和环氧化酶2(COX-2)的变化,明确炎症介质在肌腱病发病中的作用。为肌腱病研究提供理想的细胞牵拉模型及重要的实验依据。方法1.用聚二甲基硅氧烷预聚物(PDMS)与固化剂以10:1(体积比)制备微沟槽硅树脂培养皿。对微沟槽硅树脂培养皿进行超大负荷牵拉,牵拉幅度达12%,频率2.0Hz,时间24小时,观察培养皿抗牵拉情况;培养皿表面滴加提高细胞黏附的纤维结合素连接蛋白(ProNectin-F)后将人肌腱细胞接种于培养皿上,普通培养皿上接种人肌腱细胞作为对照组,倒置光显微镜对比观察细胞形态、存活情况及排列情况;计数贴壁存活细胞数和接种细胞数计算细胞贴壁率;2.利用步进电机带动的机械力对微沟槽硅树脂培养皿进行单轴动力牵拉,可编程控制器配控制循环载荷牵伸装置的运转速度及时间,调节对培养皿的牵拉频率和时间;更换不同大小凸轮对培养皿实行不同牵拉强度。检测对新型肌腱细胞循环牵伸载荷系统的机械性能及稳定性;初步观察肌腱细胞在循环牵伸载荷下生物学表现;3.新型肌腱细胞循环牵伸载荷系统对体外培养人肌腱细胞进行不同强度及频率的牵拉。设定牵拉频率0.5Hz,牵拉时间12小时,牵拉后培养24小时,根据不同牵拉强度设4%,8%,12%牵拉组,非牵拉组作空白对照,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测不同牵拉强度下前列腺素E2(PGE2)和白介素1β(IL-1β)变化;设定牵拉强度8%,牵拉时间12小时,牵拉后培养24小时,根据不同牵拉频率设0.5Hz,1.0Hz,1.5Hz牵拉组,非牵拉组作空白对照,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测不同牵拉频率下前列腺素E2(PGE2)和白介素1β(IL-1β)变化;设定牵拉频率0.5Hz,牵拉时间4小时,牵拉后培养4小时,根据不同牵拉强度设4%,8%,12%牵拉组,非牵拉组作空白对照,蛋白质印迹技术(Western blot)检测不同牵拉强度下人肌腱细胞COX-2蛋白质表达。结果1.微沟槽硅树脂培养皿参数:微槽宽和槽间桥宽均为10μm,槽深3μm,培养皿表面积为3cm×6cm。微沟槽硅树脂培养皿在超大负荷下牵拉下无断裂及撕裂,弹性良好;微沟槽硅树脂培养皿上肌腱细胞生长及贴壁良好,细胞呈平行排列,与体内肌腱细胞排列方向类似,而光滑面培养上肌腱细胞排列杂乱无章;肌腱细胞在微沟槽硅树脂培养皿和普通培养皿上细胞贴壁率无明显差别;2.新型肌腱细胞循环牵伸载荷系统通过更换不同凸轮大小,能实现不同牵拉强度2%,4%,8%,12%控制;电子控制频率可调节范围为:0.1-2Hz,可调节量为:0.1Hz,时间可调节范围为0-24小时,可调节量为:1分钟;该系统能按预定的强度、频率及时间对微沟槽硅树脂培养皿进行牵拉,运行良好且稳定;3.牵拉频率0.5Hz,牵拉时间12小时,4%牵拉组,8%牵拉组,12%牵拉组,非牵拉组PGE2量分别为:499.97±73.71 pg/万个细胞,559.11±55.89 pg/万个细胞,1132.84±42.24 pg/万个细胞,1507.72±40.86 pg/万个细胞,IL-1β浓度分别为:6.35±0.64 pg/ml,7.52±0.66 pg/ml,8.88±1.21 pg/ml,16.64±3.25 pg/ml,经统计学分析,PGE2在8%和12%牵拉强度时明显增加(P<0.05);而IL-1β在12%牵拉强度下明显增高(P<0.05)。牵拉强度8%,牵拉时间12小时,0.5Hz牵拉组,1.0Hz牵拉组,1.5Hz牵拉组,非牵拉组PGE2量分别为:645.31±24.76pg/万个细胞,1038.162±42.41 pg/万个细胞,1649.06±265.30 pg/万个细胞,1756.70±250.68 pg/万个细胞,IL-1β浓度分别为:6.88±1.91 pg/ml,9.54±0.15pg/ml,13.80±3.63 pg/ml,15.88±3.5 pg/ml,经统计学分析,PGE2产生的量,0.5Hz牵拉组,1.0Hz牵拉组,1.5Hz牵拉组与非牵拉组相比明显增高,有统计学意义(P<0.05);而IL-1β在1.5Hz牵拉频率下比非牵拉组明显增高(P<0.05)。人肌腱细胞COX-2蛋白表达情况:4%、8%、12%牵拉组灰度值逐渐增加,与非牵拉组有统计学意义(P<0.01)。结论1.微沟槽硅树脂培养皿弹性良好,能满足不同牵拉强度、频率和时间的需要,培养皿经消毒后可以反复使用;微沟槽硅树脂培养皿上人肌腱细胞生长及贴壁生长良好,肌腱细胞呈平行排列,与体内类似;2.新型肌腱细胞循环牵伸载荷系统是一个好的体外肌腱细胞牵伸载荷模型,具有运行稳定,可控性强等特点;3.人肌腱细胞在循环牵伸载荷条件下可以产生炎症介质,炎症介质增高的程度与牵拉负荷有关,为肌腱病的炎症介质学说提供了实验依据。