漆酶(benzenediol:oxygen oxidoreductases; EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,其作用底物非常广泛,能催化多种酚类化合物和大量含羟基、酸基或氨基等基团的化合物的氧化,并同时将分子氧还原成水。按其来源漆酶可以分为植物漆酶性和动物性漆酶两大类,其中动物性中的真菌白腐菌(white rot fungi)是漆酶的主要生产者。近年来漆酶一直都是环境保护、生物检测、造纸工业、食品工业等领域中重点研究的焦点。阿特拉津是一种在世界范围广泛使用的长残效、中偏低毒除草剂。常用于玉米、高梁、甘蔗等旱田作物除草,其极性较大,且在环境中较为稳定,能抵抗水中的自然递降分解作用,能随着地表径流、淋溶、沉降等多种途径对地表水和地下水造成污染。研究表明环境中的阿特拉津对野生两栖动物生殖功能有极大的影响,被世界野生动物基金会(WWF)列为环境荷尔蒙物质,有内分泌紊乱作用,是潜在的致癌物。本文对白腐菌Coprinopsis cinerea okayama7#130(C.cinerea)漆酶的分离纯化、酶学性质以及其对农药阿特拉津最适降解条件进行了研究,主要结果如下所示：1C. cinerea漆酶分离纯化(1)硫酸铵沉淀C.cinerea粗酶液的方法为：先用饱和度为60%的硫酸铵对C. cinerea粗酶液进行沉淀,除去沉淀部分后,将剩余部分再用90%饱和度的硫酸铵进行二次沉淀,除去上清,收集沉淀。(2)白腐菌C. cinerea发酵液离心除去沉淀,得到的上清经过60%饱和度的硫酸铵沉淀后取上清,再用90%饱和度的硫酸铵二次沉淀,收集沉淀透析后层析纯化,通过计算最终得到结果见表2-2：回收率为24.01%,纯化倍数为2.42,比活力为4435.63U/mg。2C.cinerea漆酶的酶学性质C.cinerea漆酶的最适pH为6.5,35℃保持1h后测定的漆酶活力,C. cinerea漆酶在中性偏酸性环境较为稳定。C. cinerea漆酶的最适温度为40℃,该漆酶在20-60℃具有较好的稳定性。Mg2+、Cu2+对C. cinerea漆酶酶活性有促进作用,A13+、Fe3+、Fe2+、Ca2+对C. cinerea漆酶酶活性有抑制作用, Na+、K+、Zn2+、Co2+、Mn2+对C. cinerea漆酶酶活性的影响不明显。以邻联甲苯胺为底物测得的漆酶的Km值为0.745mmo1/L。3C. cinerea漆酶对阿特拉津降解中单因素影响结果(1)在相同条件下,阿特拉津初始浓度的增加,阿特拉津的降解量的下降趋势越来越大,而由初始浓度5mg/L到10mg/L阶段,降解量的下降趋势非常缓慢；在反应前漆酶活力和反应体系体积等条件相同的条件下,随着阿特拉津初始浓度的增加,漆酶活力呈缓慢下降趋势；综合考虑,最后确定了整个降解试验过程中阿特拉津的初始浓度确定为10mg/L。(2)反应时间在72小时阿特拉津降解率达到最大值,之后就无变化,从节约时间和能源的角度,同时确保反应进行完全,在阿特拉津整个降解试验中,反应时间确定为3d。(3)随着pH值的升高,阿特拉津的降解率呈现先升高后降低的趋势。并且当pH值为7时,阿特拉津的降解率达到最大。最后确定漆酶对阿特拉津降解过程中,反应体系最适的pH值为7。(4)在20-35℃的温度范围内,随着温度的升高,阿特拉津的降解率随之升高,并在35℃达到最大降解率,之后开始缓慢下降,过了45℃后骤降。在30-40℃的温度范围内,漆酶对莠去津的降解效果相对稳定。在无漆酶的体系中,阿特拉津的浓度基本不变,即不会因为挥发而损失。即阿特拉津浓度的降低是漆酶作用的结果。(5)考虑到各方面问题,最适反应体系体积确定为5mL。(6)摇床转速在90-180r/min范围内,阿特拉津的降解率随着转速的提高而升高,当转速超过180r/min后,有一个缓慢降低的趋势,基本上保持不变。考虑到节能等方面的问题,本试验最适的摇床转速确定为180r/mmin。(7)漆酶活力在50-500U/mL的活力范围内,阿特拉津的降解率随着漆酶活力的增加而升高,即对阿特拉津的降解作用随着酶活力的增多而增强。综合考虑,本试验中C.cinerea漆酶对阿特拉津的降解过程中,漆酶活力确定为400U/mL。4、C.cinerea漆酶对阿特拉津最适降解条件优化结果利用响应面法对影响阿特拉津降解的主要因素进行优化,得出最优降解条件：pH为值6.9,温度为38.3℃,反应体系体积为5.3mL,转速186r/min。在此条件下,阿特拉津降解率响应预测值为52.41%,验证值为52.32%。最适条件下的降解率提高了10%-15%,这为降低阿特拉津对环境的危害提供了科学依据。