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牛结核病(bovine tuberculosis)是主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人畜共患传染病。牛分枝杆菌作为能同时感染人和牛的主要的结核病致病源,虽然与结核分枝杆菌有着超过99.9%的基因相似度,但是对于感染宿主所发挥的致病作用却有着巨大的不同。牛分枝杆菌相比于结核分枝杆菌有着更广的感染宿主范围。控制牛结核病的传播不但有利于畜牧业的健康发展,同时对保障人类健康也有着重大意义。蛋白酪氨酸磷酸酶A(PtpA)是分枝杆菌基因组中一段具有重要调控作用的基因,对分枝杆菌侵染机体发挥着重要作用。分枝杆菌PtpA可通过磷酸化作用使得分枝杆菌在进入机体后逃避机体免疫清除作用,尤其是在对抗巨噬细胞吞噬作用中,PtpA的磷酸化调控作用发挥着巨大的影响。而对于牛分枝杆菌PtpA基因是如何通过调节细胞信号通路帮助牛分枝杆菌逃避免疫清除作用的具体机理,是否和结核分枝杆菌中PtpA基因有着类似的作用目前还不清楚,明确该机理可为牛结核病防治以及疫苗的研究提供一个全新的方向。本研究以牛分枝杆菌DNA为模板,通过PCR方法得到PtpA克隆片段并将其连接到载体质粒pMD18-T Vector上,经测序完全正确后将目的基因克隆到原核表达载体质粒pET-32a(+)以及真核表达载体质粒p3×FLAG-CMV-10中,构建了pET-PtpA、FLAG-PtpA重组质粒,并将pET-PtpA转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,得到PtpA重组蛋白(包含6×的组氨酸标签),经SDS-PAGE电泳分析其蛋白大小约为35 kDa。经实验筛选得到该重组蛋白表达的最佳诱导条件为:26℃、IPTG终浓度1 mmol/L、170 rpm震荡培养5 h。经Western-Blot分析,重组蛋白可与经商业化试剂盒鉴定的牛结核阳性血清中的特异性抗体发生结合,可作为免疫抗原为后续建立牛结核病检测方法提供有效材料。诱导表达后的PtpA蛋白经SDS-PAGE电泳进行可溶性分析,结果表明:所表达的PtpA重组蛋白呈可溶性表达,主要存在于破碎上清中。破碎上清中的PtpA重组蛋白经镍柱亲和层析法纯化后可获得纯度较高的PtpA重组蛋白。以PtpA重组蛋白作为抗原并与弗氏佐剂混合,经完全乳化后多次免疫实验动物,分离血液得到含有抗PtpA多克隆抗体的血清。得到的抗血清经间接ELISA方法检测分析其抗体效价,以PtpA蛋白终浓度为每孔2μg条件下,获得的抗PtpA多抗效价超过1:1 000 000。制备的PtpA多克隆抗体通过Western-Blot实验分析其特异性,实验结果显示:制备的PtpA多克隆抗体可与真核表达的PtpA蛋白有效结合。综合抗体效价检测结果与特异性实验分析结果,制备的抗PtpA多克隆抗体具有较好的灵敏性及特异性,可作为实验材料用于后续筛选PtpA互作蛋白的研究。将FLAG-PtpA重组质粒和pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]报告基因质粒共转染于HEK293T细胞中。以10 ng/mL的TNF-α刺激转染细胞,通过检测不同时间点相对荧光强度分析PtpA蛋白对NF-κB信号通路的调控作用。结果表明:PtpA蛋白过表达对NF-κB信号通路的激活具有明显的抑制作用。并经荧光定量PCR(qRT-PCR)分析不同时间点PtpA蛋白对NF-κB信号传导相关细胞因子(IL-6,GM-CSF,BIRC-2,BIRC-3)mRNA表达量的影响。实验结果表明:PtpA蛋白在细胞受到外界刺激产生后的早期对NF-κB信号通路相关细胞因子(IL-6,GM-CSF,BIRC-2,BIRC-3)mRN A表达量具有显著的抑制作用。