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伏马毒素(Fumonisins)是由串珠镰刀菌产生的一类双酯型代谢产物,目前已经发现的伏马毒素有28种,其主要成分是伏马毒素B1 (FB1)。FB1主要存在于粮食作物和饲料中,具有神经毒性、肝肾毒性和肺毒性等,还可诱发癌症,对人类和动物的健康构成严重的威胁。目前常用于检测FB1的检测方法有多种,包括薄层析色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等,但这些方法都具有需要特殊的仪器,耗时较长,且需要专业人员操作等不足。因此,建立针对FB1快速、简便、灵敏的检测方法具有重要的现实意义。本试验利用单克隆抗体制备及酶联免疫吸附技术,建立了检测FB1含量的ELISA检测方法。该方法具有操作简单,成本低,特异性强等特点,适合大批量样品的快速检测。1.FB1人工抗原的合成与鉴定。根据伏马毒素B1分子结构特点,使用戊二醛一步法将FB1分别与BSA和OVA偶联,合成免疫抗原FB1-BSA与检测抗原FB1-OVA。通过紫外扫描、SDS-PAGE及免疫学方法初步判断FB1与载体蛋白偶联成功。利用BCA法测得FB1-BSA和FB1-OVA的蛋白浓度分别为0.70mg/mL,1.83mg/mL。2.FB1单克隆抗体的制备。将免疫抗原FB1-BSA常规免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。五免之后一周断尾采血检测抗体效价在1：10,000以上。加强免疫3d后取免疫小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。利用HAT选择性培养基及酶联免疫吸附技术筛选出阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法进行亚克隆,最后筛选出2株能稳定分泌抗FB1单克隆抗体杂交瘤细胞。5F5和2C6所制腹水效价均达到1：256,000,腹水蛋白浓度分别为10.79mg/mL和12.21mg/mL。3. ELISA检测方法的建立。选取5F5杂交瘤细胞注射小鼠腹腔,制备小鼠腹水,建立检测FB1间接竞争ELISA法。利用方阵法确定包被抗原最佳工作浓度为1：2,000,腹水最佳工作浓度1：8,000。制备FB1药物抑制标准曲线,线性方程为y=0.1648x+0.3706(R2=0.9845),半数抑制浓度(IC5o)为6.1 ng/mL, LOD低于0.05ng/mL。交叉试验结果显示,制备的单克隆抗体对FB1抑制率100%,与呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZON)等基本无交叉反应。4.回收试验。利用建立的间接竞争ELISA法对饲料玉米进行了FB1添加回收试验。对玉米样品中FB1进行模拟提取,当提取液作8倍以上稀释处理时,基质干扰基本消失,在0.05-500ng/mL范围内标准曲线方程为y=0.1381x+0.4225(R2=0.9822)。在玉米中添加5,50,200,500 nng/mL 4个浓度FB1标准品做添加回收率,结果回收率在84.2%-102.6%之间,变异系数在2.48%～8.79%。