H9N2亚型禽流感属低致病性禽流感,是危害商品肉鸡、高产蛋鸡和种鸡的一种重要疫病,也是目前鸡群中流行范围最广、危害较大的疫病之一。自1992年在我国首次发生以来,至今已成为养鸡场的一种常见多发病。本研究通过对H9N2流行株的致病性、血凝抑制试验、鸡胚中和实验、疫苗免疫保护试验等评价了山东省H9N2流行株的抗原性变化；从全基因组角度解析了山东省近年来H9N2流行毒的基因重排特点,重点研究了1999年～2013年间H9N2血凝素蛋白(HA)的遗传变异规律。此外,探讨了基因变异对病毒抗原性的影响,研究了二者的变异相关性。1.H9N2病毒山东株的分离、鉴定与生物学特性测定在山东发病鸡群中分离鉴定了35株H9N2业型(其中2010年前分离鉴定19株,2010-2013年分离鉴定16株),排除了外源病毒感染,利用终浓度稀释法进行了病毒纯化和生物学毒力测定,其中2010年以后分离的毒株的EID50/0.1ml在107.83～109.20之间,IVPI结果为0～0.17,与本实验室在1999年～2010年分离的毒株H9N2进行了生物学比较,毒力有所增强,应警惕H9N2毒力增强的趋势。2.H9N2病毒全基因组分析对HA基因的系统发育研究表明：分离鉴定的35株H9N2流行株均属于欧业谱系,其中有BJ94-1ike(1996～2005,3株)、Y280-1ike(1999-2009,4株)：S2-1ike(2010-2013,28株),这表明S2-1ike业群为近年来山东地区H9N2主要的流行株。其中对2010年以后的16株流行毒之间核苷酸、氨基酸同源性分别为94.5%-100%、96.1%-100%,但与经典疫苗SD-1996的核苷酸、氨基酸同源性已降至90.0%-92.5%、91.8%～95.0%。蛋白裂解位点分析表明：1994年～2010年的H9N2流行毒株,其蛋白裂解位点基序多为PARSSRGL,而2010年以后的毒株则多数为PSRSSRGL,仍符合低致病性禽流感的序列特征,这与生物学毒力检测指标一致。选取CK/SD/S2/05等8个不同年代的流行株进行全基因组测序,发现均属于欧业谱系,相比HA和NA基因,除NS基因较为保守外,其它6个编码蛋白的遗传演化表现为多样性。CK/SD/DY/2009.CK/SD/SIX/2010.CK/SD/YT07/2010、CK/SD/HKY1/2013的PB2和M基因均来源于G1-like,CK/SD/BD/2008的PB2基因来源于F98-1ike,M基因来源于G1-like;而早期的分离毒株及参考株均来源于BJ94-1ike或F98-1ike。2005年之前的毒株属BJ94-like基因型,而2008年以后的毒株PB1、PA、NP基因属于F98-like,NA、NS基因属于BJ94-1ike,M基因属于G1-like,而在PB2.HA基因上出现F98-like.G1-like和BJ94-like.S2-like的变化。这表明H9N2亚型禽流感病毒流行毒株的发生了不同程度的重排现象,产生了多种基因型的H9N2病毒。3.H9N2病毒血凝素抗原性分析综合HA基因分型结果,筛选不同遗传进化分支上的代表性病毒(8株),分别进行HI交叉抑制。结果发现,同源病毒对其本身血凝抑制效价较高,而不同时期的H9N2毒株之问,其HI交叉相对较低。表明我国H9N2流行病毒之间已在抗原性上发生了较大程度的变异。统计学分析表明,H9N2亚型AIVHI相关指数与其HA基因氨基酸的同源性具有显著相关性(p<0.05),Y=-3.53X+2.4487,R=0.6398。说明H9N2亚型AIV的HI抗原性主要与HA丛因的遗传变异相关。进一步利用鸡胚中和试验也证明了这一点。4.疫苗免疫攻毒评价疫苗攻毒保护试验表明：利用流行株制备的疫苗与经典疫苗相比,其攻毒后的临床症状、病毒分离率及排毒量均显著降低,SD/96疫苗株对于YZ/00、JN/05这2个不同流行毒株对攻毒的保护率为80%,而对于流行株LC02/13的保护率只有40%；LC02/13灭活疫苗对于这4个流行株攻毒后的保护率为100%,进而证实利用新流行株制备的疫苗具有更好的保护效果。本论文对近年来山东鸡群中H9N2亚型禽流感的遗传演化与抗原性进行了系统分析与研究,同时进行了疫苗免疫效果评价探讨,研究结果为山东省H9N2亚型禽流感的防控提供了理论依据。