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第一部分:HCNO-YCS-03体外抑瘤活性和乏氧选择性研究
目的:
HCNO-YCS-03是一种喜树碱(camptothecin，CPT)类衍生物，该衍生物在喜树碱类药物拓扑替康(topotecin，TPT)1号位点加载乏氧触发器氮氧结构。在乏氧环境下，HCNO-YCS-03可有效还原激活，发挥杀灭肿瘤作用。本研究应用体外细胞培养技术及流式细胞术，研究HCNO-YCS-03体外抑瘤活性及乏氧选择性。
方法:
应用TPT作为阳性对照药物，MTT法测定HCNO-YCS-03对人源性肺癌A549细胞、胰腺癌Panc-1细胞、肝癌HepG2细胞和胃癌SGC-7901细胞在常氧和乏氧两种环境下抑制作用，比较体外抑制作用强度及乏氧选择性。选择合适的瘤株，应用流式细胞术检测肺癌A549细胞在不同培养时间和不同药物浓度下凋亡情况。
结果:
1.MTT法筛选:HCNO-YCS-03在常氧环境下对A549，Panc-1，SGC-7901和HepG2细胞IC50值分别为16.1±1.6μg/ml，11.5±0.9μg/ml，21.5±3.8μg/ml，15.8±2.2μg/ml;HCNO-YCS-03在乏氧环境下对这4株肿瘤株的IC50值分别为3.3±0.5μg/ml，4.1±0.7μg/ml，16.7±3.4μg/ml，9.0±1.4μg/ml;TPT在常氧环境下对这4株肿瘤株的IC50值分别为2.9±0.3μg/ml，2.2±1.0μg/ml，26.5±5.9μg/ml，8.4±1.7μg/ml;TPT在乏氧环境下对这4株肿瘤株的IC50值分别为2.0±0.6μg/ml，1.9±0.3μg/ml，17.5±4.7μg/ml，6.8±0.9μg/ml。上述数据说明HCNO-YCS-03在体外对多种肿瘤细胞有细胞毒性作用，尤其对A549细胞，HCNO-YCS-03具有明显乏氧选择性，其常氧、乏氧环境下IC50值有统计学差异p＜0.05，细胞毒作用与阳性药物TPT相当。
2.流式细胞术检测:乏氧环境下，1μg/ml、4μg/ml和16μg/mlHCNO-YCS-03作用于A549细胞24h细胞凋亡率分别为(31.3±3.7)％、(49.3±4.2)％和(65.7±5.7)％，4μg/mlHCNO-YCS-03作用12、24和48h的凋亡率分别为(22.9±3.4)％、(49.3±4.2)％和(58.6±4.9)％，与空白对照组(12.4±1.7)％的细胞凋亡率相比，随着药物浓度和给药时间延长，细胞凋亡率显著增加p＜0.05。而在常氧环境下，1μg/ml、4μg/ml和16μg/mlHCNO-YCS-03作用24h的凋亡率分别为(17.4±2.5)％、(21.9±2.1)％和(28.6±3.2)％，4μg/mlHCNO-YCS-03作用12、24和48h的凋亡率分别为(13.4±2.8％)、(21.9±2.1)％和(26.3±3.0)％，与空白对照组(10.2±1.3)％的凋亡率相比，随着药物浓度和给药时间延长，细胞凋亡率也显著增加p＜0.05，但增加幅度不如乏氧环境下显著。说明HCNO-YCS-03对肺癌A549细胞具有很好乏氧选择性，并且对A549细胞凋亡的诱导呈剂量和时间依赖性。
结论:
1、HCNO-YCS-03在体外对肺癌A549细胞、胰腺癌Panc-1细胞、胃癌SGC-7901细胞和肝癌HepG2细胞均有一定细胞毒性，尤其对肺癌A549细胞的毒性作用最强，其IC50值与阳性药物TPT相当;
2、HCNO-YCS-03具有很好的乏氧选择性;
3、HCNO-YCS-03对肺癌A549细胞的抑制作用呈时间和剂量依赖性;
第二部分:HCNO-YCS-03体内抑瘤活性、HIF-1α活性影响及毒副作用研究
目的:
研究HCNO-YCS-03体内抗肺癌A549细胞活性、A549细胞缺氧诱导因子1α（hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α）表达的影响及药物的毒副作用。
方法:
收集对数生长期A549细胞，用生理盐水重悬并调整细胞浓度至5×107/ml。取4-6周龄裸鼠，每只右侧腋窝皮下注射0.2ml细胞悬液，建立A549移植瘤模型。建模第12天移植瘤体积100±20mm3时，随机分为四组:空白对照组（生理盐水）、低剂量组(HCNO-YCS-035mg/kg)、高剂量组(HCNO-YCS-0310mg/kg)和阳性对照组(TPT2mg/kg)，分别予以生理盐水、HCNO-YCS-035mg/kg、HCNO-YCS-0310mg/kg和TPT2mg/kg腹腔给药进行干预，评估HCNO-YCS-03对肿瘤生长抑制作用。切取肿瘤组织行组织切片检查，TUNEL法检测HCNO-YCS-03对肿瘤组织细胞凋亡诱导作用。免疫组化法检测HCNO-YCS-03对HIF-1α的影响。同时对干预结束荷瘤鼠行血液学检查，以检测HCNO-YCS-03毒副作用。
结果:
1.荷瘤鼠肿瘤抑制作用观测HCNO-YCS-03两剂量组荷瘤鼠体重与空白对照组无明显差别，而阳性对照组荷瘤鼠体重明显低于其他三组p＜0.05。高剂量组荷瘤鼠中位生存期明显大于空白对照组和阳性对照组p＜0.05，而阳性对照组中位生存期与空白对照组几乎相同。这些说明，HCNO-YCS-03的毒副作用明显低于TPT。
空白对照组与其他三组之间比较，其他三组肿瘤体积明显下降p＜0.05，其中高剂量组肿瘤体积大于阳性对照组，但无统计学差异。低剂量组、高剂量组和阳性对照组肿瘤抑制率分别为31.4％、49.7％和57.7％，高剂量组肿瘤抑制率较阳性对照低，但无显著差异。说明HCNO-YCS-03在体内有显著抗肿瘤活性，但较TPT稍弱。
2.TUNEL法检测细胞凋亡低剂量组、高剂量组、阳性对照组与空白对照组组比较，肿瘤细胞凋亡率明显上升p＜0.05;高剂量组肿瘤细胞凋亡率明显低于阳性对照组p＜0.05。说明HCNO-YCS-03在体内有显著的抗肿瘤活性，但较TPT弱。
3.免疫组化法检测HIF-1α低剂量组、高剂量组、阳性对照组与生理盐水组比较，HIF-1α表达明显受到抑制p＜0.05;高剂量组对HIF-1α的抑制能力较阳性对照组差，但两组间差异无统计学意义。结果说明HCNO-YCS-03可显著抑制肿瘤组织HIF-1α的表达。
4.血液学检查评估药物毒副作用低剂量组、高剂量组与空白对照组比较，荷瘤鼠的白细胞(Whitebloodcell,WBC)、红细胞(Redbloodcell，RBC)、血红蛋白(Hemoglobin，Hb)、血小板(platelet,PLT)以及肝肾功能相关指标（谷丙转氨酶（Alanineaminotransferase,ALT）、碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AKP)、肌酐(Creatinine，CREA)、尿素氮(Urea,UREA))均无明显差异。阳性对照组荷瘤鼠的WBC和PLT明显低于其他三组p＜0.05，而肝功能相关指标(ALT、AKP)则明显高于其他三组p＜0.05。说明HCNO-YCS-03具有较低毒副作用，明显改善了喜树碱类化合物的毒副作用。
结论:
1、HCNO-YCS-03可有效抑制肺癌A549移植瘤的生长，其体内抑瘤能力较阳性药物TPT稍弱。
2、HCNO-YCS-03可显著抑制肿瘤组织HIF-1α的表达。
3、HCNO-YCS-03具有较低毒副作用，明显改善了喜树碱类化合物的毒副作用。