基因重复(gene duplication)是新基因形成的重要机制,在遗传进化和生物演化中发挥着重要的作用,其中由RNA介导的基因重复形成的反转座基因(retrocopy)通常被认为是无功能的,但近来的相关研究在果蝇、斑马鱼及一些哺乳动物和植物等的基因组中都已筛选出大量有功能的反转座基因,并且其中一些基因的功能已经通过实验得到证实。秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是多细胞动物中第一个被测定全基因组序列的生物,现已成为发育生物学、神经生物学、细胞凋亡、疾病与衰老等研究领域的模式生物,也是研究比较基因组学及系统演化的理想实验材料,但其反转座基因的研究尚处于起步阶段。2012年Zou等对秀丽线虫基因组中的反转座基因进行筛选共发现43个反转座基因(如ssp-31),根据公共表达数据库以及RT-PCR实验的结果推测其中大部分反转座基因都可以表达,且可能具有一定的功能,但尚未通过实验对其在线虫不同发育期的表达量差异及生物学功能进行分析和验证。本实验根据反转座基因可表达、dN/dS小于0.5、p值小于0.01的标准以及本实验室的研究方向(线虫的生殖发育),最终选择了秀丽线虫反转座基因ssp-31进行研究,该基因隶属于精子特异性蛋白(SSP)家族,该家族共有12个成员。根据wormbase网站公布的对SSP家族成员的RNA干扰实验结果和脂肪代谢与线虫生殖发育关联性的研究,推测反转座基因ssp-31可能在线虫的脂肪代谢、生长发育以及生殖能力等方面具有一定功能性,但目前对于反转座基因ssp-31功能的相关研究尚属空白。本文是首次对秀丽线虫反转座基因sssp-31的表达和功能进行初步研究。首先利用RT-PCR技术扩增出ssp-31基因331bp的片段,以确定该基因可以表达,并利用荧光定量PCR技术对该基因在秀丽线虫生长发育不同时期(卵、L3、L4及成虫)的表达量进行了分析。结果表明ssp-31基因在卵及成虫期的表达量较高,在L3和L4期的表达量则较低,且存在显著性差异(p<0.05),故推测该基因属于母源性基因,可能在线虫的产卵行为等方面起作用。进一步采用RNA干扰技术,对ssp-31基因的生物学功能进行研究。实验首先克隆了长度331bp的ssp-31基因片段,并在测序后将其与线虫RNA干扰表达载体L4440进行连接,成功构建出重组干扰载体L4440-ssp-31；然后将重组载体转化入大肠杆菌HT115感受态细胞,利用IPTG诱导ds RNA的表达,通过喂食的方法使秀丽线虫的ssp-31基因沉默,并获得了较好的干扰效果。结果发现该基因沉默的线虫主要出现如下现象：(1)线虫产卵总量由对照组的278±7降低到255±8(p<0.05),但卵的孵化率由对照组的78.5±1.5%增高到97.8±0.9%(p<0.001),因此总的子代数则由对照组的219±11增加到249±8(p<0.05)；(2)产卵周期由对照组的6-8天缩短至5天；(3)第一天和第二天产卵量由对照组的8±5和60±6分别增高到33±5(p<0.01)和92±7(p<0.01),第四天和第五天的产卵量则由对照组的81±2和37±5分别降低到31±110<0.01)和3±3(p<0.001)；(4)产卵高峰期缩短,由对照组的3天(第2、3、4天)缩短为2天(第2、3天)；(5)对秀丽线虫体内脂肪进行染色并进行图片灰度分析发现,干扰组线虫体内脂肪含量有极显著性的增加(p<0.001)；(6)秀丽线虫在身体形态、运动、卵及幼虫生长发育等方面无异常。以上实验结果表明ssp-31基因沉默后产卵量下降,卵孵化率增高,从而表现出子代数量显著增加的特征。线虫通过缩短产卵周期和产卵高峰期来显著地降低线虫的产卵总量,这可能是由于多不饱和脂肪酸PUFA的含量过多引起的；线虫子代数量的显著增加则可能是因为ssp-31基因参与调控其他脂代谢相关基因的表达量(与nhr-64基因相似),也可能是因为线虫体内PUFA含量的增加增强了线虫精子的定向运动能力而最终导致孵化率增高(与fat-2、fat-3突变体相似)。综上所述,本研究证实秀丽线虫反转座基因ssp-31在调控秀丽线虫的脂肪代谢以及生殖能力方面有一定的功能。