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目的：体外分离、培养、冻存、复苏小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblasts,MEF),并对其生物学特性进行研究。以MEF作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)。探讨hESC定向分化为间质干细胞的方法与机制,初步研究人胚胎干细胞来源的间质干细胞(human embryonic stem cell-derivedmesenchymal stem cells,hESC-MSCs)的基本生物学特性。
方法：用0.083％、0.125％、0.25％的胰酶分步消化组织块分离培养MEF,对MEF形态、生长曲线、细胞周期、贴壁率、细胞化学染色、冻存与复苏等特性进行观察研究。以3代以内的MEF作为饲养层培养、传代hESC,观察其未分化特性。分别用机械法、拟胚体法分离、培养、纯化hESC-MSCs,对其形态、生长特性进行观察,用流式细胞术、免疫荧光检测细胞表面标记,核型分析检测其染色体,细胞化学染色观察其生物化学特性,RT—PCR测定相关基因的表达情况。并用丝裂霉素处理,观察其作为饲养层支持hESC生长的能力。
结果：胰酶分步消化法获得的MEF为长梭形,冻存复苏后的MEF在体外培养30min时80％以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性。hESC在MEF饲养层上传30代以上其形态保持不变,AKP染色阳性,具有自发分化形成拟胚体的能力。机械法、拟胚体分化法共得到3株hESC-MSCs,其形态一致,呈细长梭形,体积较大,与骨髓间质干细胞相似；hESC-MSCs生长曲线显示细胞增殖较快,第3天生长速度开始加快,第7天达到高峰；细胞化学染色显示AKP、POX为阴性,PAS为弱阳性；流式分析表面标记显示hESC-MSCs表达CD29、CD44、CD13,但不表达CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR；hESC-MSCs核型仍然为46,XY；hESC-MSCs表达间质干细胞相关基因nucleostemin、TGF-β、N-cadherin、sall-4、snail、twist,不表达上皮细胞相关基因E-cadherin。作为饲养层可以支持hESC生长。
结论：胰酶分步消化法是分离MEF的较好方法,此方法所获得的MEF经冻存复苏后有较高的生物学活性,可支持hESC传代、培养,并保持hESC未分化特性。hESC在体外能分化为间质干细胞,hESC-MSCs在细胞形态、生长方式、细胞表面标记、基因表达等方面符合间质干细胞的特性。