研究背景：肺癌是一种起源于支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤,其发病率居男性恶性肿瘤的第1位、女性恶性肿瘤的第2位,是恶性肿瘤中最常见的死亡原因之一[¨,随着空气污染和吸烟人数的增加,肺癌将对人类健康和生命构成极大的威胁。肺癌早期多无明显症状,尤其是占肺癌约80%的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)[2],多数患者确诊时已属中晚期,有远处病灶转移,失去根治手术机会,化疗和放疗虽可一定程度上缩小瘤体并改善生存质量,但NSCLC对放化疗敏感性较差,再加上放射线及化疗药物的毒副作用,导致了肺癌患者的低生存率和预后不良。有调查指出,ⅢA期NSCLC患者其5年生存率为15-23%,而ⅢB期NSCLC患者的5年生存率仅为6-7%。肺癌患者对放疗、化疗的耐受性及肿瘤的生长、复发和转移是影响预后的主要因素。与其它肿瘤疾病一样,肺癌的发生也是一个多基因、多因素参与的积累性基因损伤的复杂过程,癌基因的激活及过表达,抑癌基因的缺失或失活等多种基因的突变始终贯穿在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等各个时期,而且突变可以遗传。肿瘤的发生发展、浸润及转移均与基因的异常有极其密切的关系。从基因水平治疗肿瘤为肿瘤的根本性治愈提供了希望,显示出良好的治疗前景。近年来,随着对肿瘤发生发展机制研究的不断深入及分子生物学技术的不断发展,肿瘤的基因治疗发展迅猛,成为了目前肿瘤治疗研究的热点和新希望。其中,基因治疗的一个分支就是：利用反义技术、核酶技术或RNAi技术特异性地抑制癌基因及其产物,从而抑制肿瘤细胞的生长,或恢复其对放化疗的敏感性。RNAi技术自被发现以来,就迅速成为生命科学研究中的热点领域。RNAi是指利用21-23bp长双链RNA诱导与其有同源序列的mRNA降解的过程,可以高效、特异地阻断体内特定基因表达,使细胞表现出特定基因缺失的表型。与反义核酸、核酶等技术相比,RNAi技术具有特异性高、持续时间长、抑制基因表达效率高以及细胞内的转导更易于实现等特点,是新型的调控基因表达的有力手段。RNAi技术的出现为各种疾病如病毒所致的疾病、肿瘤的防治及新基因功能的研究打开了一条新的途径[6]。因此,寻找合适的表观遗传学干涉靶点,利用RNAi技术特异性抑制相关的基因及其产物,从而抑制肿瘤细胞生长及转移,有望为肿瘤临床治疗开辟新途径。Zeste基因抑制子基因12(suppressor of Zeste12, SUZ12)是多梳蛋白家族(Polycomb group protein, PcG)的核心亚基之一,可通过影响组蛋白甲基化转移酶的活性及EED-EZH2复合物的基因沉默效应而实现其转录修饰功能,作为一种原癌基因,其在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡以及增强细胞恶性转化能力等方面发挥着重要的调控作用。多项研究证实,SUZ12在前列腺癌、胃癌、乳腺癌、神经系统肿瘤等多种恶性肿瘤中异常高表达并与肿瘤的预后不良密切相关,在正常的胃壁和乳腺上皮细胞中转入野生型的SUZ12表达质粒可促进细胞的恶性转化,而下调SUZ12的表达可有效抑制肿瘤细胞的增殖能力,表明SUZ12可能参与调控肿瘤的形成过程,并有望成为肿瘤临床治疗的新靶点。SUZ12与多种恶性肿瘤的浸润转移关系密切。有学者对乳腺癌中最常见的浸润型导管癌与SUZ12的关系作了研究,发现SUZ12的mRNA及蛋白水平表达均较高,SUZ12的高表达与腋窝淋巴结转移、雌激素受体阳性状况等具有明显的相关性,表明其与乳腺浸润型导管癌的进展及转移有关。Li等在卵巢癌相关研究中发现,SUZ12蛋白在癌组织中的高表达也与肿瘤进展相关。此外,有文献报道,下调SUZ12能有效降低MNK1等多种胃癌细胞的侵袭能力。SUZ12在永生化的上皮细胞中过度表达并在癌细胞的发生发展及转移中发挥重要作用[14]。肺癌是严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤之一,肿瘤细胞体内恶性增殖、侵袭和转移是导致其高死亡率的主要原因。SUZ12在多种恶性肿瘤细胞中高表达并与其增殖、转移能力有关。纵观目前国外PcG与肺癌相关的研究,虽然EZH2[15]及Bmi-1等PcG核心亚基在肺癌组织中的表达和肺癌患者的临床分期、肿瘤浸润深度的关系己经逐步明确,然而目前仍缺乏有关肺癌细胞中SUZ12的表达及其与细胞增殖、浸润及转移的关系的系统性研究。因此本文将致力于研究SUZ12对人非小细胞肺癌增殖转移的抑制作用及其机制。研究目的：本课题拟以人非小细胞肺癌A549细胞株为实验对象,检测SUZ12基因在人非小细胞肺癌细胞株中的表达情况,观察沉默SUZ12的表达对细胞增殖及侵袭迁移能力的影响并初步探究相关分子机制,以期为以SUZ12作为临床肺癌治疗的新靶点提供理论和实验依据。研究方法：1.沉默SUZ12基因对肺癌细胞株A549增殖的抑制作用及其机制研究(1) Western blot法检测SUZ12蛋白在胚胎人肺上皮细胞L132、正常人支气管上皮细胞NHBE、16HBE及非小细胞型肺癌A549细胞中的表达差异；(2)针对SUZ12基因设计siRNA,并通过阳离子脂质体法瞬时转染至A549细胞,Western blot检测siRNA对SUZ12的沉默情况,并筛选出沉默效率最高的序列；MTT法检测沉默SUZ12基因对正常肺上皮细胞及A549增殖能力的影响；平板克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力变化；裸鼠体内实验观察细胞体内增殖能力的变化；流式细胞术检测细胞凋亡及周期的变化；β-半乳糖酐酶染色法检测细胞衰老情况；(3)在进一步的机制研究中,以Western blot法分别检测肺癌细胞中PcG家族蛋白EED、EZH2及其催化的H3K27me3,细胞周期调节蛋白CyclinD1、CDK2、 CDK4、CDK6、P21和P27,衰老调控蛋白p16INK4a、P14ARF、P53、Rb、pRb、E2F1的表达情况；(4)为探究沉默SUZ12影响肺癌细胞增殖的分子机制,通过靶向CDKN2A(P16/P14)的干扰序列CDKN2A-siRNA与SUZ12-siRNA共转染同时沉默A549细胞株中的P16INK4a、P14ARF和SUZ12的表达,MTT法检测细胞增殖能力变化；平板克隆形成实验检测克隆形成的变化；流式细胞术检测周期的变化；β-半乳糖酐酶染色法观察细胞衰老情况。2.沉默SUZ12基因对肺癌细胞株A549体外转移的抑制作用及其机制研究(1) SUZ12-siRNA转染A549细胞,Transwell小室迁移实验检测细胞体外迁移能力的变化；(2) SUZ12-siRNA转染A549细胞,Transwell小室侵袭实验检测细胞体外侵袭能力的变化；(3) Western blot法检测细胞转录因子Snail, EMT相关蛋白E-cadherin、 N-cadherin、Vimentin,基质金属蛋白酶MMP-2及其抑制剂TIMP-1表达水平的变化。实验结果：1.沉默SUZ12基因对肺癌细胞株A549增殖的抑制作用及其机制研究(1)A549细胞SUZ12的蛋白表达量分别是NHBE、16HBE、L132细胞的(5.16±0.77)、(2.44±0.29)、(2.32±0.34)倍,表明SUZ12在肺癌细胞中呈高表达(2) siRNA转染可有效沉默A549细胞中SUZ12基因的表达,Western blot结果显示：SUZ12-siRNA-003序列沉默效果最佳；MTT结果显示：与未转染组相比,SUZ12-siRNA组细胞增殖能力在转染第三天开始明显受到抑制,在第四天时抑制最为明显；沉默SUZ12基因对正常细胞增殖无明显抑制作用；与未转染组相比,siRNA沉默SUZ12表达后A549细胞增殖率明显升高[(8.92±6.42)%vs(52.96±6.35)%,P<0.01],而NHBE,16HBE, L132细胞增殖率无显著性变化(P>0.05),表明沉默SUZ12-siRNA对人肺正常细胞增殖的影响较小；平板克隆形成实验结果显示：克隆形成数在未转染组、阴性对照组和SUZ12-siRNA转染组分别是(86.00±11.00)、(82.30±10.50)和(26.00±6.60)个,表明SUZ12-siRNA组细胞的克隆形成能力明显受抑；裸鼠成瘤实验结果显示：所有裸鼠均有瘤体形成,正常对照组和阴性对照组平均瘤重分别为342.97±28.88mg和310.03±59.32mg。SUZ12-siRNA转染组瘤体平均瘤重177.15±24.32mg,抑瘤率为48.35%；流式细胞术检测结果发现：细胞凋亡率在未转染组、阴性对照组和SUZ12-siRNA转染组分别是(2.49±0.94)%、(2.78±0.64)%和(3.66±1.25)%,差异无统计学意义(P>0.05),即SUZ12-siRNA对A549细胞无明显的凋亡诱导作用；同时,G1期细胞比例在未转染组、阴性对照组和SUZ12-siRNA转染组分别是(57.08士2.30)%、(57.16士3.51)%和(78.29士2.88)%,S期细胞比例分别是(23.53士4.35)%、(26.45士1.38)%和(13.82士0.86)%,G2期细胞比例分别是(19.39士2.39)%、(16.39士3.61)%和(7.98士2.55)%,细胞发生G0/G1期阻滞；β-半乳糖酐酶染色结果显示：与未转染组相比,SUZ12-siRNA组细胞出现明显的衰老现象；(3)在进一步的机制研究中,Western blot法检测结果显示：SUZ12-siRNA转染72h后PcG家族蛋白EZH2、EED及其介导的H3K27me3表达均明显下调；细胞周期蛋白CyclinD1、CDK2、CDK4、CDK6的表达明显下调,而P21、P27的表达明显上调；衰老调控蛋白P16INK4a、P14ARF、P53和Rb的表达明显上调,E2F1和pRb的表达水平明显下调。(4)与SUZ12-siRNA转染组相比,(SUZ12+CDKN2A)-siRNA组细胞增殖抑制率下降(62.64±4.16)%；克隆形成率上升(59.84±14.47)%；G1期细胞比例下降(13.72±5.29)%,G0/G1期阻滞解除；细胞未出现明显的衰老现象。2.沉默SUZ12基因对肺癌细胞株A549体外转移的抑制作用及其机制研究(1)迁移实验结果显示：SUZ12-siRNA转染组迁移细胞数相对于未转染组下降了(72.86±6.72)%,细胞体外迁移能力显著受抑。(2)侵袭实验结果显示：SUZ12-siRNA转染组侵袭细胞数相对于未转染组下降了(70.33±7.17)%,细胞体外侵袭能力显著受抑。(3) Western blot法检测结果显示：SUZ12-siRNA转染72h后肺癌细胞内E-cadherin TIMP-1的表达明显上调,而Snail、N-cadherin、Vimentin和MMP-2的表达明显下调。实验结论：1.SUZ12在正常细胞中呈低表达,在肺癌细胞中呈高表达,沉默SUZ12对肺癌细胞增殖的抑制率高而对正常细胞影响较小。2.沉默SUZ12基因表达可显著抑制肺癌细胞株A549的增殖能力,这可能是通过解除PRC2介导的基因沉默效应并重新激活细胞内INK4a/ARF信号通路而阻滞周期进程、诱导细胞衰老实现的；3.沉默SUZ12基因表达能抑制肺癌细胞株A549侵袭迁移能力,这可能是通过降低细胞增殖活性、解除对钙粘着蛋白的抑制效应而逆转肿瘤细胞EMT的发生以及改变细胞外基质金属蛋白酶的表达水平等几方面共同作用的结果,但其具体的分子机制尚有待进一步研究；4.SUZ12的表达与肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为密切相关,该基因有望成为抑制肺癌复发和转移的重要靶点。