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为探索绿原酸(CGA)和姜黄素(CUR)对氨氮胁迫下的黄颡鱼巨噬细胞炎症反应的影响,本研究以黄颡鱼头肾巨噬细胞为研究对象,采用非连续密度梯度法对黄颡鱼头肾巨噬细胞进行分离培养;利用MTT法测定氨氮对黄颡鱼头肾巨噬细胞的半抑制浓度(IC50)和绿原酸、姜黄素对氨氮胁迫下的细胞存活率的影响,采用q RT-PCR法检测IL-1、TNF-α、SOD、Bcl-2、Arg-1等与巨噬细胞炎症反应、抗氧化能力、抗凋亡、极化等过程密切相关的基因表达水平,DCF测定检测细胞内的ROS水平,TUNEL染色观察巨噬细胞凋亡情况等。本研究将深化人们对氨氮胁迫下鱼类炎症分子机制的认识,同时为黄颡鱼功能性饲料添加剂筛选提供理论依据。本研究主要结果如下:(1)黄颡鱼头肾巨噬细胞的分离培养与鉴定:采用非连续密度梯度法分离黄颡鱼头肾巨噬细胞,细胞存活率较高,贴壁纯化后的黄颡鱼头肾巨噬细胞,纯化率可达98%以上。吉姆萨染色以及细胞超微结构观察,巨噬细胞的细胞核偏于一侧,呈圆形,椭圆形及不规则形状;核膜清晰完整,胞浆中可见各类细胞器且结构完整清晰,胞浆内还含有黑色素颗粒以及吞噬囊泡,细胞外部存在伪足。(2)绿原酸对氨氮诱导下黄颡鱼巨噬细胞炎症反应的影响:通过氨氮胁迫试验,首先确定氨氮在24h对黄颡鱼头肾巨噬细胞半抑制浓度(IC50)为0.23mg/L。然后用氨氮半抑制浓度进行试验,共设置6个试验组,即空白对照组(CON)、氨氮胁迫组(IC50,AM)、绿原酸组(125μM,CGA)、氨氮+5μM绿原酸组(5A)、氨氮+25μM绿原酸组(25A)、氨氮+125μM绿原酸组(125A),其中绿原酸均预处理1 h,然后再用氨氮(IC50)胁迫处理24 h,每组6个重复。结果显示:AM组相对细胞存活率显著低于其他各组(P<0.05),CON组显著高于5A、25A和125A三组(P<0.05);与对照组(CON)相比,AM组IL-1、IL-6、TNF-α、COX-2、NF-κB p65的m RNA水平都显著上升(P<0.05),在氨氮胁迫下适当补充绿原酸有效降低IL-1、IL-6、TNF-α、COX-2、NF-κB p65的m RNA水平(P<0.05);25A组SOD的m RNA水平显著高于CON组(P<0.05),5A和25A组GPx的m RNA水平高显著高于CON组(P<0.05);AM组Bcl-2的m RNA水平显著低于CGA、5A、25A以及125A组(P<0.05)。AM组Arg-1的m RNA水平最低,且显著低于125A组(P<0.05)。DCF测定检测细胞内的ROS相对水平,AM组ROS相对水平显著高于其他各组(P<0.05),CGA组与CON组无显著差异(P>0.05),但显著低于5A、25A和125A组(P<0.05)。通过TUNEL染色法观察,CON、CGA、5A、25A和125A组红色荧光信号(凋亡)较少,甚至几乎看不见,而在AM组中可见大量红色荧光信号(凋亡)。(3)姜黄素对氨氮诱导下黄颡鱼巨噬细胞炎症反应的影响:共设置6个试验组,即空白对照组(CON)、氨氮胁迫组(IC50,AM)、姜黄素组(45μM,CUR)、氨氮+5μM绿原酸组(5A)、氨氮+25μM绿原酸组(25A)、氨氮+45μM绿原酸组(45A),其中姜黄素均预处理1 h,然后再用氨氮(IC50)胁迫处理24 h,每组6个重复。结果显示:AM组相对细胞存活率与5A组无明显差异(P>0.05),但显著低于其他各组(P<0.05),CON和CUR组间差异不显著,但均显著高于5A、25A和45A三组(P<0.05);AM组IL-1、IL-6、TNF-α、COX-2、NF-κB p65、SOD、GPx的m RNA水平都显著上升(P<0.05),适当姜黄素可以有效降低氨氮胁迫下头肾巨噬细胞IL-1、IL-6、TNF-α、COX-2、NF-κB p65、SOD、GPx的m RNA水平(P<0.05);AM、5A和45A三组Bcl-2的m RNA水平无显著差异(P>0.05),但均显著低于CUR和25A组(P<0.05);CON、AM和CUR组三组之间Arg-1的m RNA水平无显著差异(P>0.05),但均显著低于5A、25A和45A三个组(P<0.05)。DCF测定检测细胞内的ROS相对水平,AM组ROS相对水平最高,显著高于其他各组(P<0.05),5A和45A组差异不明显(P>0.05),但均显著高于CON、CUR和25A组(P<0.05),CUR组ROS相对水平最低,显著低于CON和25A组(P<0.05)。通过TUNEL染色法观察,CON、CUR、5A、25A和125A组红色荧光信号(凋亡)较少,甚至几乎看不见,而在AM组中可见大量红色荧光信号(凋亡)。结论:氨氮胁迫引起黄颡鱼头肾巨噬细胞炎症反应、氧化应激以及细胞凋亡,氨氮的促炎作用与NF-κB p65以及COX-2信号通路有关;CGA和CUR能缓解由氨氮胁迫导致的黄颡鱼巨噬细胞炎症反应、氧化应激以及细胞凋亡,同时诱导巨噬细胞M2型极化。而CGA和CUR可能通过直接中和自由基或者其他抗炎途径发挥其抗氧化活性。