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芋螺毒素(conotoxin,CTx)是由软体动物芋螺分泌出来的一类活性多肽,主要用来捕食猎物和防御天敌。每种芋螺能够产生超过1000多种不同类型的芋螺毒素多肽,它们能够高效特异的作用于多种膜蛋白,其中多数种类能够抑制电压或配体门控离子通道。芋螺毒素可以根据其结构和功能特征进行分类,如半胱氨酸模式和药理学活性。芋螺毒素家族中,作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)的芋螺毒素种类最多,尤其是α-芋螺毒素。现有研究表明,nAChRs与多种神经系统疾病相关,包括疼痛,癫痫,帕金森病和成瘾等。因此,芋螺毒素不但可以开发为研究nAChRs的工具探针,而且还能作为先导药物分子直接作为药物进行研究。但是芋螺毒素作为一类多肽,存在易被蛋白酶水解,体内半衰期短,生物利用度低等缺点。本研究中,我们利用不同方法对4种作用nAChRs的芋螺毒素进行化学修饰改造,包括利用D-型氨基酸突变改造 α-CTx RgIA 和 αO-CTx GeXIVA、骨架环化 α-CTx LvIA、以及 α-CTx TxID序列中Met替换改造研究,以期获得活性或稳定性更好的芋螺毒素突变体,提高这4种芋螺毒素的药用价值。α-CTx RgIA是α9α10 nAChR的竞争性拮抗剂,它对鼠源α9αt10 nAChR的活性非常强,但对人源α9α10 nAChR的活性却很弱,且RgIA序列中含有四个精氨酸,容易被多种蛋白酶降解,为了改善RgIA的这些缺点,我们采用D-型氨基酸扫描方法合成RgIA突变体,研究氨基酸的立体异构改变对其活性的影响,希望能够获得更稳定的RgIA突变体,增强RgIA的生物利用度。本研究一共合成了 15个RgIA突变体,活性筛选实验结果表明其中14种突变体对鼠源α9α10 nAChR的活性显著降低,仅RgIA[13r]保留了与本体一致的生物活性。另外两个突变体RgIA[7,9,11,13-r]和RgIA[7,9,11-r#]序列中的所有L-Args都被D-Args取代,其对鼠源α9α10 nAChR的活性丧失,但保持了对人源α9α10 nAChR的活性。稳定性实验显示这三种突变体在人血清中稳定性显著提高,而且RgIA[7,9,11,13-r]和RgIA[7,9,11-r#]在模拟肠液(SIF)中的稳定性也大幅度提升。αO-CTx GeXIVA(GeXIVA)是本实验室从Conusgenerαlis中克隆而来的新型芋螺毒素,同样是α9α10 nAChR的高选择性竞争性拮抗剂,能够治疗神经病理性疼痛。与结构紧凑的α-芋螺毒素相比,GeXIVA含有8个精氨酸,且结构较为松散,很容易被各种蛋白酶降解。为了提高GeXIVA的稳定性,我们合成了 7个GeXIVA的D-型氨基酸替代突变体,主要替换了 GeXIVA的C-和N-末端侧翼氨基酸和内部的L-Arg。电生理实验结果表明所有D-型氨基酸替代突变体都保持或提升了原有的活性,其中GeXIVA[15-18r]对α9αl0 nAChR的活性提升了约2.5倍。稳定性实验表明,所有突变体在人血清中的稳定性都有提升,其中GeXIVA[all-r]和GeXIVA[1t,28v,all-r]两种突变体稳定性增加最为明显,在人血清中的半衰期从30分钟提升至8-12小时,且GeXIVA[1t,28v,all-r]甚至可以在模拟肠液中存在90分钟。本研究与RgIA的改造共同揭示了恰当的D-型氨基酸取代既能够保留原始肽的生物活性,也可以增强芋螺毒素多肽的稳定性,从而提升芋螺毒素的药用价值。α-CTx LvIA从Conuslividus中克隆获得,对α3β2 nAChR的活性非常强,且能够区分α3β2及非常接近的α6/α3β2β3 nAChR。本研究中,我们通过使用首尾化学连接法(HCL)合成了 3个具有不同氨基酸数量接头的LvIA环肽突变体,希望能够进一步提升它的稳定性。实验结果表明具有6个氨基酸接头的环化突变体能够最大程度保留其对α3β2 nAChR的活性,同时在人血清中的稳定性也得到了提升,该研究结果表明环化是改善芋螺毒素稳定性的有效策略之一。α-CTx TxID是本实验室从Conus textile中发现获得,属于4/6-型亚家族芋螺毒素,能够特异性抑制α3β4 nAChR。但TxID中的第11位甲硫氨酸(Met)在氧化环境下容易形成甲硫氨酸亚砜(MetO)结构,从而导致其活性显著降低。本研究中,我们选择了 8种不同的氨基酸替代甲硫氨酸,总共合成了 8个替换突变体。电生理实验结果显示大多数TxID的替换突变体对α3β4 nAChR活性降低超过10倍,其中有5个突变体对α3β4 nAChR完全没有抑制作用,唯有[M11I]TxID对α3β4 nAChR的活性保持最好,其半阻断剂量为69nM,与本体相比活性降低了 3.8倍。实验表明,采用较为疏水的异亮氨酸(Ile)替换Met是减少Met氧化对TxID影响的最佳策略,本研究也有助于设计改造序列中含有Met的芋螺毒素多肽。芋螺毒素含有的氨基酸数目较少,适合采用化学方法合成,这也让化学修饰改造芋螺毒素成为可能。上述研究表明,通过D-型氨基酸取代,环化和氨基酸突变等方法改造芋螺毒素,可以在保持芋螺毒素活性的同时提高其稳定性,从而提升芋螺毒素开发为药物的潜能。