自噬(Autophagy,AP)是真核生物将细胞内冗余或受损伤的蛋白质及细胞器用双层膜包裹运往液泡或溶酶体中降解再利用的过程,在生物体正常发育、衰老或遭受生物、非生物胁迫过程中发挥重要作用。关于自噬的研究早期主要集中在酵母和哺乳动物,近些年来在植物中的研究逐渐增多,但主要局限于在生物和非生物胁迫条件下的细胞的自噬,另外还局限于植物的营养生长过程,对正常生长发育过程中,尤其是植物的生殖过程中的自噬还鲜有研究。之前本实验室在透射电镜下观察发现蜀葵和油菜减数分裂期小孢子母细胞内存在复杂的类自噬体结构,但它们是否代表真正的自噬体以及它们的形成机制和功能还不清楚。为此,本研究以蜀葵为材料,通过自噬特异性染色剂MDC染色、自噬抑制剂3-MA和E-64预处理以及亚显微结构观察,对蜀葵小孢子母细胞(MMCs)中的自噬现象做了进一步定性的研究。主要结果如下:(1)MDC染色后荧光显微镜观察发现,正常生长条件下的早期和减数分裂期MMCs细胞质呈绿色或蓝色荧光,其内分布有数量不等的蓝色亮点,这些亮点即代表自噬体,这些亮点主要分布在细胞边缘,有些亮点在细胞边缘聚集成大的亮斑。减数分裂期MMCs内亮点的数目明显多于早期MMCs。小孢子时期亮点消失。(2)3-MA预处理24 h和36 h之后荧光显微镜观察发现,细胞质呈绿色荧光,但自噬体数目比正常组细胞(不经任何处理的细胞)稍有增多,但与DMSO对照组相比显著减少。DMSO对照组与正常组细胞相比,细胞内自噬体数目显著增多。(3)E-64预处理24 h和36 h之后荧光显微镜观察发现,细胞呈蓝色或绿色荧光,细胞内自噬体数目比正常组细胞和DMSO对照组细胞内的自噬体数目显著增多。DMSO对照组细胞内自噬体数目与正常组细胞相比也明显增多。(4)普通荧光显微镜观察发现,正常条件下的小孢子体积较小,大小均一。3-MA预处理后,大部分(70%)小孢子体积相对变大,大小变得不均匀;相反,E-64预处理后,大部分(80%)小孢子体积变小,大小也变得不均一。(5)RT-PCR检测发现,自噬相关基因ATG8在蜀葵根、茎、叶、小孢子母细胞、四分体、小孢子中都有表达。(6)亚显微结构观察显示,早期蜀葵MMCs内的确有典型的自噬体结构存在。其形成过程有:细胞内先出现新月状双层膜结构,这种结构的膜继续延伸形成杯状,最后膜两端融合形成自噬体结构,并将一些受损细胞器及蛋白包裹在内。随着细胞的发育,部分自噬体被周围另外的膜包裹形成多层膜结构;部分自噬体内膜断裂并卷曲,形成胞内体。最后,部分自噬体与质膜融合,将内含物排放到质膜与细胞壁之间,部分自噬体与液泡融合并降解。综上可知,蜀葵小孢子发生过程中细胞内的确有自噬活动参与。