核酶(Ribozyme，RZ)是一类具有酶活性的RNA分子，可序列特异性地与靶RNA分子配对，对底物进行切割，促进mRNA的降解，从而使其失去生物活性。其阻断有害基因表达的作用已得到证实。同反义核酸比较，核酶具有封闭和切割双重作用的特点，更重要的是核酶可以重复发挥催化作用，一个分子可以破坏多个靶RNA，在切割完一个靶RNA分子后，又可以从杂交链上解脱下来，对新的RNA进行切割反应。研究表明，核酶具有较单链的反义核酸更为稳定和简单的空间结构，不易受到核酸酶的破坏，因结构简单，可以人工设计。因此核酶的发现为肿瘤基因治疗提供了更具特异性的新手段。目前用于基因治疗的核酶主要是锤头状核酶和发夹状核酶，与锤头状核酶相比，发夹状核酶的作用条件同人体生理条件更接近，其催化活性是锤头状核酶的数十倍。高效性和作用条件同生理条件比较接近，决定了发夹状核酶用于体内阻断基因表达可能具有更为广阔的前景。 肿瘤的生长、进展与转移需要血管形成，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最重要的血管形成因子之一，它可高效特异性地作用于血管内皮细胞，刺激血管的发生与生长，同时促进血管内物质泄露，为血管内皮细胞的迁移及肿瘤细胞的转移提供基质。卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，其早期诊断困难，发现时时多属晚期，因此多年来死亡率一直高居妇科恶性肿瘤之首。近年来的研究表明，卵巢癌组织及细胞中存在VEGF及其受体的高表达，且VEGF的表达与卵巢癌患者的预后密切相关。因此，采用核酶技术阻断卵巢肿瘤细胞中VEGF的过量表达，有可能阻止肿瘤细胞的增殖，为卵巢肿瘤的治疗开创一条新途径。研究内容包括： 1．采用RT－PCR方法克隆了576hP的人VEGF基因，构建了重组载体‘pUC19－VEGF（＋）和pcDNA3一VEGF（－）。酶切鉴定及序歹分析表明，重组载体构建正确，所克隆的VEGF基因与人基因库VEGF序列完全一致。 2．免疫组化检测表明，恶性肿瘤及交界性肿瘤VEGF和KDR的表达明显高于良性肿瘤。KDR不仅表达于肿瘤血管内皮细胞，在肿瘤细胞内也有强表达。有淋巴结转移的卵巢癌VEGF表达与无淋巴结转移者相比较有显著差异。表明VEGF及其受体在卵巢癌发生中可能起重要作用。 3．采用计算机辅助设计并合成了切割VEGFmRNA的发夹状核酶，二级结构分析预测显示该核酶具有较理想的切割位点，基因库同源性分析显示无其他基因mRNA带有能同上述核酶结合部位互补的碱基序列。 4．采用粘端连接法成功地将核酶基因克隆入真核表达载体pCDNA3的 EcoRI和 BarnHI位点，酶切鉴定可切出 56hp的核酶片段，DNA测序分析显示所合成和克隆的核酶基因序列与设计完全一致。 5．分别从Hindlll和Xbal线性化的DNA模板上体外转录出VEGFmRNA及RZ分子，切割反应显示所设计的核酶具有良好的特异性切割活性，为核酶进一步的体内外研究奠定了基础。 6．采用脂质体介导的转染方法，成功地将核酶基因转入卵巢癌细胞，RNA斑点杂交证实核酶基因在卵巢癌细胞中表达。转染核酶基因的卵巢癌细胞VEGF＊RNA及VEGF蛋白表达水平明显降低：细胞增殖能力减弱；细胞周期显示G；期细胞明显增多，S期细胞明显减少；形态学超微结构显示细胞凋亡或退行性改变。 ．2－ 7．裸鼠致瘤实验显示，转染核酶细胞裸鼠致瘤能力明显减弱，瘤组 织中VEGF表达减少，血管形成能力降低。 实验结果表明，我们自行设计和构建的抗VEGF发夹状核酶可有效地 抑制卵巢癌细胞的异常增殖，本研究为进一步开展卵巢癌的抗血管生成 基因治疗奠定了实验基础。