中枢神经系统发育是脊椎动物胚胎发育过程中调控最复杂、次序最严谨的事件之一。胚胎神经管中的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一种维持自我更新的多潜能细胞,可以进一步分化为各种不同类型的神经细胞。在神经发育过程中,NSCs随着发育阶段的不同变换着它们的响应性和发育潜能。在早期扩增阶段,神经干细胞主要进行广泛的增殖来扩大细胞群体。随着发育的进行,一些神经干细胞在区域性神经诱导信号的作用下起始了原神经基因(proneural gene)的表达。Proneural genes是一类碱性-螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)转录因子,如Mash1、Ngn1/2和Math1等,它们可以诱导神经元特异性基因的表达,从而将多潜能的神经干细胞决定到神经元分化命运上来。随着proneural基因的表达,神经管中原本相对均一的NSCs群体开始形成差异。那些起始表达proneural基因的NSCs分化为神经元前体细胞,而未表达proneural基因的细胞仍然维持干细胞状态。随后,神经元前体细胞开始退出细胞周期,迁移至神经管外侧并分化为神经元。而NSCs仍然维持未分化状态直到神经发生晚期,再在特定神经诱导信号的作用下分化为晚期的神经细胞类型,比如胶质细胞。维持一个适当规模的NSCs群体对于神经发育的正常进行至关重要,如果NSCs提前分化则会导致严重的神经系统发育缺陷。由于NSCs没有得到充分的扩增,会最终导致神经细胞总量的下降。同时,NSCs提前分化只产生早期的神经细胞类型,从而导致晚期神经细胞类型的缺失,因而不能建立正常的中枢神经系统。除此以外,由于NSCs强大的分化潜能和自我更新能力,在医学上还具有治疗神经损伤和神经退行性变等疾病的潜能。视网膜是研究神经干细胞/神经前体细胞(Neural progenitor cells, NPCs)增殖分化的优异模型。在神经发育早期,视网膜由间脑的神经上皮向两侧形成突起发育而来,是中枢神经系统地一部分。在哺乳类神经发育过程中,视网膜前体细胞(Retinal progenitor cells, RPCs)可以分化形成视网膜中的7种主要神经细胞类型,这些不同的细胞类型在视网膜神经上皮增殖的同时依次分化出现:神经节细胞、视锥细胞及水平细胞最先生成,接着是无长突细胞和视杆细胞,最后才是双极细胞和Müller氏胶质细胞。分化中的神经细胞要迁移到适当的位置,以形成正确的细胞排列,并最终形成视网膜的五个组织层次,包括三个有核层(nuclear layers)及将它们联系在一起的两个突触层(synaptic layers),从而完成光信号的接受、转换和传导。视网膜丰富的细胞类型和规则的层次结构,是视觉功能实现的生物基础。与视网膜相同,小脑(cerebellem)特别是小脑皮层是中枢神经系统最为高度有序的结构之一。与大脑皮层相比,它的特征性和简单性使其成为研究中枢神经系统发育机制的又一经典模型。发育中过程中,由小脑室区和菱脑唇两个生发中心分化出九型神经细胞:包括浦肯野(氏)细胞、高尔基细胞、颗粒细胞、篮状细胞、星形细胞和Lugaro细胞,单极刷(形)细胞,和烛台(状)细胞,以及小脑特异性的Bergmann (氏)胶质细胞。成熟的小脑皮层由这八型神经元和一型胶质细胞排列成精确的立体结构,并形成复杂的神经环路从而实现运动协调、技能学习等重要的生理功能。在神经发育过程中,NSC/NPCs的增殖和分化受到多个信号转导途径的精确调控。以细胞膜受体Notch、转录因子RBP-J及其下游效应基因组成的Notch信号途径是调控发育过程的基本信号之一。虽然既往研究揭示出Notch途径在神经细胞分化中发挥重要的调控作用,但操作Notch途径不同分子得到的实验结果具有差别,其发挥作用的下游靶点也存在争议。基于干预单个Notch受体或其下游基因的研究方法,不足以反映Notch信号功能的全貌。由于在哺乳动物中,Rbpj编码的转录因子可以整合并传递来源于四型Notch受体的信号,从而激活下游基因转录。因此在本课题研究中,我们利用Cre-Loxp重组酶系统,在小鼠RPCs和小脑原基的NPCs中特异性剔除Rbpj基因。Rbpj敲除视网膜与野生型小鼠视网膜相比,出现明显的发育障碍和视网膜层次结构异常。视网膜发育早期,RPCs分化加速,表现为一系列proneural基因表达上调。然而,仅有神经节细胞和感光细胞增多,中间神经元数目减少,提示RBP-J缺失导致神经元提前分化和RPCs的耗竭;发育晚期,通过活体电穿孔在出生后小鼠视网膜中敲除Rbpj主要导致视杆细胞增加和Müller氏胶质细胞减少。提示RBP-J参与调控感光细胞和Müller氏胶质细胞的定向分化。此外,在Rbpj缺失的视网膜中,层状结构的紊乱伴随着视网膜外表面细胞粘附相关分子β-catenin的表达缺失。更为有趣的是,我们通过活体电穿孔在Rbpj缺失的视网膜中过表达β-catenin,观察到视网膜正常层次结构的恢复。Rbpj敲除小脑与野生型小鼠小脑相比体积显著变小,分叶结构消失。发育早期(E10.5、E12.5)小脑原基脑室区proneural基因Mash1表达上调,神经元提前分化,增殖的NPCs显著减少,表明Notch-RBP-J信号途径维持着小脑原基中NPCs的数量,并控制着小脑神经细胞分化的时程。发育晚期浦肯野细胞和颗粒细胞持续性减少,小脑深部核团几乎消失。此外,Rbpj敲除小鼠中决定菱脑峡组织者(Isthmic Organizer)建立和中后脑分界形成的重要因子在相应区域均有表达,表明Rbpj表达失活对于IO的形成没有显著性影响,同时说明Notch-RBP-J信号途径对于小脑原基发育的调控作用是直接的,而并非间接的通过调节IO建立而发挥影响。上述研究结果共同揭示RBP-J所介导的经典Notch信号途径通过抑制神经细胞分化(differentiation),从而维持足够的NSC/NPCs直至晚期发育;此外,Notch-RBP-J信号也参与神经细胞定向(specification),发挥诸如抑制视网膜感光细胞分化,以及促进Müller氏胶质细胞形成的作用;在形态发生方面,RBP-J还可能通过调控粘附相关分子β-catenin的表达参与视网膜层次结构形成;同时,我们的研究证明RBP-J对于中后脑分界的形成没有显著影响。综上所述,本课题的研究结果发现,转录因子RBP-J通过介导经典Notch信号途径调控神经细胞的定向、分化;并在特定发育环境中调节神经系统形态形成,从而协调神经发生(Neurogenesis)和形态形成(Morphogenesis)两个发育过程,最终确保神经系统正常的结构形成及功能建立。这些研究对于深入理解神经发育过程中的分子机理以及Notch信号全面的调控作用,以及了解相关人类疾病的发病机制,具有较为重要的理论和实际意义。