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目前在全世界范围内流行并给许多养猪户造成严重经济损失的疾病当中,猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）占有绝对地位,它是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种猪的急性、热性、高度接触性肠道传染病,PEDV属冠状病毒科中的α冠状病毒,感染该病的猪常表现出体温一般正常、强烈呕吐、水样腹泻等特点,仔猪和育肥猪感染后发病率接近100%,仔猪死亡率通常在一半以上,成年母猪发病率在20%左右,一般可耐过;PED的传播速度较慢,在控制不及时的情况下一般在一个月之内传遍全场。几乎所有冠状病毒中,N蛋白在疾病诊断与防治、致病机制的研究等方面都发挥着重要作用,因为冠状病毒的N蛋白具有一些特殊的功能,如可引起机体最早期的免疫应答反应,在感染初期机体便可产生抗N蛋白的高水平抗体,为疾病的诊断以及疫苗的研制提供有利条件;N蛋白氨基酸序列中含有特殊的亚细胞定位信号,且在不同病毒种类中此序列不同,可根据此信号研究N蛋白在宿主细胞中的定位特征,为冠状病毒致病机制的研究提供了可能。本实验以PEDV N蛋白为研究对象,构建N基因的重组真核质粒,对表达的重组N蛋白进行检测,并对N蛋白的亚细胞定位特征进行研究,以期为PEDV的早期诊断方法的建立及致病机制的研究奠定基础。本实验主要从以下四个方面开展研究,并取得了较好的实验结果。（1）N基因重组真核质粒的构建。本研究依据PEDV CV777株N基因的全序列设计引物,在扩增出目的基因之后与真核载体pPM-C-His连接,构建重组真核表达质粒pPM-C-His-N,并利用菌液PCR、双酶切鉴定以及测序分析对构建的真核质粒进行了验证,结果均符合预期,证明重组质粒构建成功,为后续利用该重组质粒进行实验研究提供物质材料。（2）重组质粒在Vero细胞中表达情况的鉴定。将重组质粒转染Vero细胞,并设置空载体对照组和阴性对照组,24h后提取细胞总RNA,并于转染后24h、48h、60h分别提取细胞总蛋白,检测重组质粒在基因水平和蛋白水平的表达情况;在转染48h之后利用间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测N蛋白在细胞中的分布。琼脂糖凝胶电泳与SDS-PAGE结果显示转染重组质粒组的细胞在目的片段大小处均出现了条带,并且在整个细胞中出现了特异性绿色荧光,而对照组未出现,说明该重组质粒在基因水平与蛋白水平成功表达,且能够在Vero细胞中瞬时表达。（3）重组质粒对小鼠免疫水平的影响研究。将真核质粒免疫昆明系小鼠,同时设置空载体对照组和阴性对照组;三免过后采集免疫血清,对三次采集的血清进行效价测定,并利用Western blotting对重组质粒的反应原性进行检测;在无菌环境中制备小鼠脾淋巴细胞悬液,进行淋巴细胞转化实验,测其OD570nm值,用SPSS23.0软件对数据进行处理,分析真核质粒对小鼠细胞免疫水平的影响。ELISA结果显示小鼠三免抗体效价达到1:51,200,Western blotting结果显示在目的条带大小处出现免疫印迹,而淋巴细胞转化实验显示重组质粒组淋巴细胞增殖率显著高于空白对照组和阴性对照组,而空白对照和阴性对照组差异不显著,表明了重组真核质粒pPM-C-His-N具有良好的免疫原性和反应原性,且可以显著提高小鼠细胞免疫水平,为疾病的诊断以及疫苗的研制提供理论基础与数据支持。（4）N蛋白对Vero细胞的影响研究。为了研究N蛋白亚细胞定位特征以及对Vero细胞的影响,我们根据其它冠状病毒N蛋白亚细胞定位研究的报道,首先利用生物信息学软件对PEDV N蛋白NLS序列进行分析,发现了一个潜在的核定位基序pat7,位于碱性氨基酸富集区,且表现出了与其他冠状病毒同样高的亲水性,说明此基序是一个潜在的亚细胞定位信号,为PEDV N蛋白定位特征的研究提供可能。然后我们利用DAPI对细胞核进行染色,制片之后在激光共聚焦显微镜下观察并分析N蛋白的定位特征;同时待转染48h之后固定用PI染色,进行流式细胞分析其对Vero细胞周期的影响;结果显示N蛋白主要定位于细胞质与细胞核中,并且发现了G2-M期的明显延长,表明PEDV N蛋白主要通过作用于Vero细胞的胞质与胞核,影响其对细胞有丝分裂的功能,从而对细胞周期产生影响,创造出有利于病毒复制的条件。综上所述,本实验构建的重组真核表达质粒pPM-C-His-N具有良好的反应原性和免疫原性,同时对N蛋白在Vero细胞中定位情况进行了研究,明确了病毒在宿主细胞中的作用机理,为PEDV诊断与防治方法的确立打下坚实基础。