【摘 要】
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目的探讨Apelin对D-半乳糖（D-Gal）诱导的心肌细胞衰老、线粒体结构及能量代谢的影响。方法1.D-半乳糖干预H9c2细胞建立衰老心肌模型,使用细胞计数试剂盒-8（CCK8）、β-半乳糖苷酶染色、RT-PCR测P16基因表达水平检测建模是否成功;浓度梯度法探索D-Gal和Apelin最佳工作浓度。2.电穿孔转染技术,构建APJ过表达（h-APJ）H9c2细胞、APJ低表达（Si-APJ）H9
【基金项目】
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福建省自然科学基金计划项目（基金号:2018J01237）; 2019年创双高火石基金项目（项目编号:2019HSJJ27）
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目的探讨Apelin对D-半乳糖（D-Gal）诱导的心肌细胞衰老、线粒体结构及能量代谢的影响。方法1.D-半乳糖干预H9c2细胞建立衰老心肌模型,使用细胞计数试剂盒-8（CCK8）、β-半乳糖苷酶染色、RT-PCR测P16基因表达水平检测建模是否成功;浓度梯度法探索D-Gal和Apelin最佳工作浓度。2.电穿孔转染技术,构建APJ过表达（h-APJ）H9c2细胞、APJ低表达（Si-APJ）H9c2细胞及空载对照组细胞。3.实验细胞分组:（1）空白对照组（C组）:H9c2细胞不做处理,正常培养;（2）衰老组（D组）:H9c2细胞用浓度20g/L的D-Gal干预;（3）Si-APJ D组:Si-APJ H9c2细胞用浓度为20g/L的D-Gal干预;（4）Si-APJ D+A组:Si-APJ H9c2细胞用Apelin+D-Ga干预;（5）h-APJ D组:h-APJ H9c2细胞用浓度为20g/L的D-Gal干预;（6）h-APJ D+A组:h-APJ H9c2细胞用Apelin+D-Ga干预。4.高内涵成像分析系统检测细胞荧光强度,并分析细胞线粒体膜电位、线粒体密度、线粒体大小、线粒体纹理情况;柠檬酸合酶检测试剂盒检测细胞柠檬酸合酶活性;Western Blot检测衰老标志物P16、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（PGC-1α）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A（CPT1A）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）蛋白表达情况;RT-PCR检测P16、CPT1A、GLUT4、线粒体转录因子A（TFAM）、核呼吸因子1（NRF1）m RNA表达情况。结果1.浓度梯度法探索D-Gal最佳工作浓度为20g/L,Apelin最佳工作浓度为10-7mol/L。2.与空白对照组H9c2细胞相比,衰老组P16蛋白相对表达水平及m RNA相对表达水平均上升;与h-APJ D组H9c2细胞相比,h-APJ D+A组P16蛋白相对表达水平及m RNA相对表达水平均下降;Si-APJ D+A组与Si-APJ D组H9c2细胞相比,P16蛋白及m RNA表达均无显著差异。3.与空白对照组H9c2细胞相比,衰老组柠檬酸合酶活性显著下降（P<0.01）;与h-APJ D组H9c2细胞相比,h-APJ D+A组柠檬酸合酶活性显著上升（P<0.01）;Si-APJ D+A组与Si-APJ D组H9c2细胞相比,柠檬酸合酶活性仅稍上升。4.与空白对照组H9c2细胞相比,衰老组细胞代谢活化因子PGC-1α蛋白相对表达水平降低,葡萄糖代谢标志物GLUT4、脂肪酸代谢标志物CPT1A蛋白相对表达水平及m RNA相对表达水平均降低;与h-APJ D组H9c2细胞相比,h-APJ D+A组细胞代谢活化因子PGC-1α蛋白相对表达水平升高,葡萄糖代谢标志物GLUT4、脂肪酸代谢标志物CPT1A蛋白相对表达水平及m RNA相对表达水平也均升高;Si-APJ D+A组与Si-APJ D组H9c2细胞相比,细胞代谢活化因子PGC-1α蛋白表达水平无显著差异,葡萄糖代谢标志物GLUT4、脂肪酸代谢标志物CPT1A蛋白及m RNA表达均无显著差异。5.与空白对照组H9c2细胞相比,衰老组细胞线粒体膜电位下降（P<0.01）、线粒体生物合成能力降低,而线粒体大小及线粒体纹理未发生明显改变;h-APJ D+A组与h-APJ D组H9c2细胞相比,细胞线粒体膜电位、线粒体生物合成、线粒体大小及线粒体纹理均无明显差异;Si-APJ D+A组与Si-APJ D组H9c2细胞相比,细胞线粒体膜电位、线粒体生物合成、线粒体大小及线粒体纹理也均无显著差异。结论Apelin对D-Gal诱导的心肌细胞衰老有保护作用,可逆转D-Gal诱导的衰老心肌细胞线粒体代谢受损,而对D-Gal诱导的心肌细胞线粒体结构损伤及线粒体生物合成能力下降无明显改善作用。
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