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研究目的以手术及放化疗为主的胃癌治疗已经进入平台期。过去三十年中,以凋亡蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物研发取得了一定的进展,但受凋亡蛋白高频可变剪接、肿瘤异质性等因素的影响,凋亡相关靶向药物在临床应用特别是在胃癌等实体肿瘤中疗效欠佳。因此,基于凋亡因子可变剪接调控的抗肿瘤研究引起广泛关注,但在胃癌中的相关研究尚未见相关报道。Mcl-1分子是Bcl-2凋亡基因家族的核心成员,Mcl-1 pre-mRNA可通过可变剪接表达抗凋亡蛋白Mcl-1L和促凋亡蛋白Mcl-1S两种剪接异构体。基于Mcl-1可变剪接的干预有望通过改变肿瘤细胞抗凋亡状态、促进肿瘤细胞凋亡而成为胃癌治疗的新策略和新靶点。本研究通过临床研究,明确凋亡因子Mcl-1可变剪接与胃癌病理分级、临床分期、生存预后的相关性;通过细胞学实验,探讨空间阻滞寡核苷酸(SBOs)调控Mcl-1可变剪接进而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖的生物学效应;通过裸鼠移植瘤实验,在体内验证SBOs治疗对肿瘤组织Mcl-1可变剪接的调控作用及其促进肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤生长增殖的作用。研究方法临床研究:应用基因表达谱交互分析软件GEPIA分析来源于TCGA数据库的408例胃癌组织以及36例正常胃粘膜组织中Mcl-1 mRNA表达情况及其与胃癌病理分级、临床分期、生存预后之间的相关性;收集59例胃腺癌患者新鲜胃癌组织和31例胃炎患者胃黏膜组织,应用荧光定量PCR技术定量检测Mcl-1可变剪接产物Mcl-1L及Mcl-1S的mRNA表达;利用Western blotting技术对Mcl-1L及Mcl-1S蛋白表达水平进行半定量检测;Mcl-1L及Mcl-1S表达水平与胃癌病理分级、临床TNM分期、生存预后的相关性分析。体外实验:合成Mcl-1特异性SBOs,应用Endo-Porter系统转染至不同分化程度的胃癌细胞系(MKN-28(高分化)、SGC-7901(中分化)、MKN-45(低分化));RT-q PCR及Western blotting技术检测转染不同浓度SBOs细胞的Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡关键标志物(Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3),评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡活化状态;CCK8增殖实验评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的增殖能力。体内实验:应用胃癌细胞系种植裸鼠背前壁皮下部位建立MKN-45和HGC-27两种胃癌移植瘤模型;通过瘤体局部多点注射不同剂量Mcl-1特异性SBOs,注射3天后处死裸鼠;记录裸鼠移植瘤体积治疗前后变化并组间比对分析;RT-q PCR及Western blotting技术检测不同浓度SBOs治疗后癌组织Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;HE染色后计算SBOs治疗后肿瘤组织细胞死亡面积;免疫荧光技术原位观察肿瘤组织细胞凋亡;组织研磨后制备组织细胞悬液,应用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率,同时应用Western blotting检测细胞凋亡关键标志物(Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3),评价不同剂量SBOs治疗的胃癌组织的肿瘤凋亡活化状态;应用免疫组化技术检测细胞增殖指标Ki-67表达。研究结果临床研究:与正常胃粘膜组织相比,肿瘤组织中Mcl-1L mRNA表达显著升高(p<0.05),与之相反,Mcl-1S mRNA表达则显著降低(p<0.01),Mcl-1S/Mcl-1L mRNA亦明显降低(p<0.001);与mRNA表达水平差异相一致,在胃癌组织中,Mcl-1L蛋白表达明显升高,Mcl-1S蛋白表达水平显著降低;同时,Mcl-1S与Mcl-1L mRNA表达水平的比值与胃癌T分期呈负相关,与N分期无明显关联性;Kaplan Meier生存分析显示,低Mcl-1S/Mcl-1L mRNA水平胃癌患者的总生存期低于Mcl-1S/Mcl-1L mRNA高水平胃癌患者。体外实验:相对GES-1正常细胞,不同分化程度的胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Mcl-1L表达明显升高,Mcl-1S表达显著降低,但胃癌细胞株组间无显著差异;转染不同浓度SBOs 48 h后,Mcl-1L mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性降低,而Mcl-1S mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性增加;与mRNA水平的定量变化相似,SBOs处理的胃癌细胞系中,Mcl-1L蛋白表达水平下降,Mcl-1S蛋白表达水平升高;流式细胞术检测SBOs处理的胃癌细胞系显示三株细胞凋亡率均呈SBOs剂量依赖性升高;SBOs处理的胃癌细胞系中,细胞凋亡关键标志物(Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3)表达显著升高;转染不同浓度SBOs胃癌细胞的CCK8 OD值呈SBOs剂量依赖性升高。体内实验:SBOs治疗后,MKN-45和HGC-27两种小鼠移植瘤组织中Mcl-1S mRNA及蛋白表达上调,而Mcl-1L表达显著下调;肿瘤组织HE染色显示,相对于对照组,SBOs治疗组移植瘤组织细胞死亡面积呈SBOs剂量依赖性增加;免疫荧光原位检测显示,治疗后癌组织原位肿瘤细胞凋亡数量亦呈SBOs剂量依赖性增加;流式细胞术定量检测细胞凋亡显示,MKN-45异种移植模型中Con-SBO、6.25和12.5 mg/kg SBOs治疗组肿瘤细胞凋亡率分别为2.76%、14.44%和28.75%,在HGC-27异种移植模型中肿瘤细胞凋亡率分别为2.49%、31.26%和50.57%;SBOs治疗后,肿瘤组织中细胞凋亡关键标志物Bak、cleaved caspase9和cleaved caspase 3表达水平明显升高;SBOs治疗组肿瘤体积基本保持稳定,而对照组肿瘤体积增长超过30%;免疫组化检测显示,SBOs治疗组肿瘤生存能力和增殖的指标Ki-67表达率呈SBOs剂量依赖性下降。研究结论1.凋亡因子Mcl-1可变剪接异构体Mcl-1L和Mcl-1S在胃癌中表达不平衡,与胃癌临床进展及预后不良密切相关。2.Mcl-1特异性SBOs可以调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接从Mcl-1L转换为Mcl-1S mRNA剪接模式,抑制抗凋亡可变剪接异构体Mcl-1L的表达,诱导促凋亡异构体Mcl-1S的表达;这种干预能有效促进不同分化程度胃癌细胞的凋亡并抑制胃癌细胞增殖。3.在活体肿瘤组织内Mcl-1特异性SBOs亦可靶向调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接,使剪接模式从Mcl-1L向Mcl-1S mRNA转换,进而诱导胃癌移植瘤组织细胞凋亡并抑制移植瘤增殖和生长。4、以Mcl-1可变剪接为靶标的细胞凋亡调控,具有较高的特异性和有效性可作为抗胃癌治疗的新方向。