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猪病毒性疾病严重影响猪生产性能和经济效益,然而猪病毒性疾病(如PRRS等)仍然还不能有效地被治愈,其中重要原因之一是对病毒致病机理、病毒与宿主(猪)间相互作用、猪抗病毒等机制及其重要基因功能还不十分清楚。因此,急需要对病毒复制具有重要调控作用的宿主基因以及细胞自身应答机制等进行研究。研究成果将在抗病育种、抗病毒药物疫苗研制等将具有重要的应用价值,以及对控制病毒传播具有重要的参考价值。CRISPR/Cas9基因编辑系统是细菌用来防御入侵病原的有效工具,CRISPR/Cas9系统是利用向导系列gRNA的识别介导Cas9蛋白的定位,对目标基因DNA进行遗传修饰。细胞自噬作为宿主体内重要的保护机制,在病毒感染过程中发挥着重要的作用。越来越多研究证实了病毒与细胞自噬间存在重要的互作,但细胞自噬对猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)复制增殖与机理还不清楚,因此本研究通过利用CRISPR/Cas9系统在猪全基因组范围内筛选与病毒感染相关的宿主基因以及细胞自噬调控猪病毒复制的作用机制方面进行了探讨。主要研究结果如下:1.证实了 CRISPR/Cas9系统在猪细胞系中能高效地诱导猪基因敲除为了确定CRISPR/Cas9基因组编辑技术能成功的敲除猪细胞中基因,首选,在猪细胞系PK15和C△2(+)细胞中分别瞬时转染Cas9表达载体和靶基因DPM1的gRNA载体,利用流式细胞仪检测发现转染的猪细胞中DPM1基因有10%左右的敲除效率,初步表明CRISPR/Cas9系统能够诱导猪细胞基因表达沉默。然后将Cas9基因整合到猪细胞中得到稳定表达Cas9的细胞系,瞬时转染基因DPM1的gRNA载体,基因敲除率达到20%-30%。进一步在Cas9稳表达的转基因猪细胞系中转染DPM1目基因gRNA进入该细胞系,并筛选获得Cas9和gRNA都稳定表达的,DPM1基因敲除效率超过80%。该结果证明了表达Cas9和gRNA能够有效的诱导靶基因的双链断裂(DSBs),而且Cas9和gRNA都稳定表达时基因敲除效率最高,可用于基因敲除和基因功能筛选等方面的研究。2.构建了猪全基因组CRISPR/Cas9文库,并且利用高通量测序鉴定了该文库具有较高诱导基因突变的效应,可以进行大规模遗传筛选为了充分利用CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的价值,设计和构建了猪全基因组CRISPR/Cas9文库;高通量测序发现该慢病毒质粒文库包含了 65316个gRNAs,并且全部的基因都含有至少2个gRNAs。进一步利用构建的慢病毒质粒文库分别两种稳定表达Cas9的猪细胞系,形成了两个猪全基因组基因敲除的猪突变细胞系。高通量测序结果分析发现两个猪突变细胞系中都包含13000多个基因,并且每个基因至少含有1个gRNA。说明构建的全基因组突变的猪突变细胞系具有很好的质量,可以进行大规模功能缺失筛选。3.利用构建的全基因组突变的猪细胞系筛选和鉴定与猪流感病毒复制相关的宿主基因本研究以猪流感病毒为研究对象,分别感染全基因组突变的猪细胞系。通过分析和筛选,初步获得了与猪流感病毒复制相关的宿主基因,筛选获得了 140个候选宿主基因。为了进一步验证筛选结果,本研究有设计合成了含有217个基因的二级文库,通过利用两种流感病毒株分别进行筛选,结果获得61个候选基因;然后通过与第一次筛选结果比对,发现有42个基因共同出现在两次筛选中。为了验证每个候选基因,本研究选择了 32个重要的候选基因分别单独设计gRNA,分别转染到Cas9稳定表达的PK15_Cas9和C△2(+)_Cas9细胞系中,感染流感病毒;利用空斑实验和激光共聚焦实验进行鉴定,该候选基因被敲除和功能缺失后不同程度地降低猪流感病毒的复制增殖,证明被筛选出候选基因在病毒复制增殖中具有一定作用。此外,该结果也同时证明了建立的猪CRISPR/Cas9技术在猪遗传筛选中具有较重要的用应用价值。4.PRRSV感染能诱导细胞自噬和凋亡,并且细胞自噬要早于PRRSV诱导的细胞凋亡以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为研究对象,以MARC-145细胞为模型开展研究。PRRSV感染后明显的触发LC3呈现点状聚集分布,并且诱导LC3 I转化成LC3Ⅱ,但是p62蛋白的表达却不断的减少,表明PRRSV感染可以诱导细胞自噬体形成。此外,通过细胞核染色发现PRRSV感染同样能诱导细胞凋亡的发生,感染后约24小时后诱导细胞凋亡。同时,利用透射电镜观察发现自噬体在感染12小时就能观察到,而细胞核在感染24小时才出现凋亡特性变化,表明细胞自噬要先于PRRSV诱导的细胞凋亡。5.细胞自噬通过抑制细胞凋亡而促进PRRSV增殖细胞自噬和凋亡间存在复杂的相互作用,本研究发现两者都参与PRRS病毒复制调控。通过利用自噬抑制剂3-MA处理细胞来抑制自噬,发现自噬抑制能够显著地提高PRRSV诱导的细胞凋亡,并且PRRSV的Nsp2蛋白表达也明显地被抑制;同时,干扰自噬相关蛋白Beclin1的表达也能增加凋亡蛋白Caspase3的活性,表明在感染前期细胞自噬能够抑制PRRSV诱导的细胞凋亡,推测PRRSV利用诱导的细胞自噬来抗细胞凋亡,使细胞在感染前期存活,为病毒复制提供空间和时间。6.Bad和Beclin1相互作用参与调控PRRSV诱导的细胞自噬本研究分析了促凋亡蛋白Bad基因和自噬相关基因Beclin1在感染过程的表达和定位的特征。在PRRSV感染过程中,Bad和Beclin1的mRNA表达水平较高;Bad在蛋白水平上的表达没有变化,而BAD的S112位点的磷酸化水平显著增加,Beclin1在蛋白水平上的表达同样增加。干扰Bad的表达后LC3点状聚集明显增多,说明Bad能够调节细胞自噬。进一步利用免疫共沉淀和共聚焦显微镜观察发现在PRRSV感染过程中Bad和Beclin1能相互结合,并且具有共定位的特征,这种相互作用并没有改变Beclin1的表达和抑制细胞自噬,但是却抑制了 Bad的表达和细胞凋亡,使得PRRSV在感染前期能够在细胞内进行大量增殖。