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霍山石斛为兰科多年生草本植物,是我国传统的名贵中草药。多糖是霍山石斛的主要活性成分之一,具有抗肿瘤、抗氧化、抗白内障和免疫调节等多种生物活性。我们的前期研究发现,霍山石斛多糖具有较强的抗白内障活性。由于晶状体上皮细胞凋亡是白内障发生的主要病理机制之一,所以本课题以此为切入点,采用酶解分子修饰方法,对霍山石斛多糖抑制晶状体上皮细胞凋亡的分子调控机制及其构效关系进行了研究,主要实验结果如下: (1)霍山石斛多糖的分离纯化和酶法修饰:霍山石斛类原球茎经水提醇沉获得总多糖,再利用DEAE-Cellulose阴离子交换层色谱以及膜分离技术(截留分子量8000Da和3500Da)对其进行分离纯化,获得多糖均一组分DHPD1。酶筛选研究发现,果胶酶较适合DHPD1的酶解修饰。通过单因素实验、响应面分析获得果胶酶降解修饰的最优条件为:酶浓度126 U/mL,反应pH4.46,反应温度48℃。在此优化条件下,以DHPD1为起始分子,通过改变反应时间(1h,8h,24h),获得了三种酶解片段DHPD1-1H、DHPD1-8H和DHPD1-24H,分子量分别为2535Da、1997Da和1552Da。 (2)DHPD1酶解片段的结构表征:单糖组成分析表明, DHPD1-1H、DHPD1-8H和DHPD1-24H均由Ara、Xyl、Man、Glc和Gal五种单糖构成,摩尔比分别为0.037:0.014:0.064:1.272:0.041、0.033:0.022:0.086:0.882:0.094和0.184:0.171:0.293:1.023:0.069。甲基化实验发现,DHPD1-1H、DHPD1-8H和DHPD1-24H均包含1-Glcp、1,4-Glcp、1,4,6-Glcp、1,3,6-Manp、1,5-Araf、1,6-Glcp、1,6-Galp和1-Xylp八种糖苷键连接方式,组成摩尔比分别为1.89:6.87:0.79:0.49:0.25:0.83:0.42:0.09、2.04:5.59:1.37:1.01:0.35:1.29:1.03:0.31和2.11:2.04:0.91:1.53:1.06:0.93:0.36:1.01。依据DHPD1的基本结构特征,采用NMR技术对这三种酶解片段的化学结构进行了鉴定,结果发现, DHPD1-24H是DHPD1、DHPD1-1H和DHPD1-8H的共同核心结构。 (3)DHPD1及其酶解片段抑制人晶状体上皮(HLE细胞)凋亡活性及其分子调控机制:MTT实验和AnnexinV-FITC/PI流式细胞术分析可知DHPD1及其酶解片段能够显著抑制H2O2诱导HLE细胞的损伤和凋亡。荧光定量RT-PCR检测发现,与正常对照组相比,H2O2不仅抑制了HLE细胞Bcl-2基因的表达,而且上调了Bax、Caspase-3、Caspase-9、IL-1β和TGF-β2的基因表达。与模型组相比,多糖处理组不仅上调了HLE细胞Bcl-2基因的表达,而且抑制了Bax、Caspase-3、Caspase-9、IL-1β和TGF-β2的基因表达。Western Blot分析发现,与对照组相比,模型组p-Akt、p-JNK、p-P38和p-ERK1/2的蛋白表达量明显提高,表明H2O2激活了PI3K/Akt和MAPK信号通路;与模型组相比,DHPD1及其酶解片段显著抑制了H2O2对PI3K/Akt和MAPK信号通路的活化效应。 综上所述,霍山石斛多糖抑制HLE细胞凋亡的作用机制可能是多糖通过对H2O2活化MAPK和PI3K/Akt等信号通路的干预作用,调节Bcl-2、Bax、Caspase-3以及Caspase-9等细胞凋亡蛋白的相对表达量,进而抑制HLE细胞的凋亡。通过对比分析DHPD1及其酶解片段结构差异与活性差异的对应关系,可以推测, DHPD1-24H是DHDP1的活性结构单元。