三七[Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]又名田三七,具有活血化瘀、消肿定痛、止血补血、提高机体免疫力等功效,药用价值高。近年来根腐病、黑斑病、圆斑病等真菌病害严重影响了三七的品质及三七产业的可持续发展,其中主要由茄腐镰刀菌导致的三七根腐病最为严重。本课题组在前期研究中发现茉莉酸信号是三七响应茄腐镰刀菌的重要信号途径,并且从三七中分离得到一系列茉莉酸响应的抗病相关基因（PnDEFL1、PnSN1、PnPR10-3、PnChI1、PnGlu1、PnPGIP）。WRKY转录因子在调控植物防御病原菌侵染的转录重编程过程中发挥重要作用,是植物防御反应过程中的重要表达基因,近年来得到了广泛的研究关注,但对三七WRKY转录因子的研究却鲜见报道,且WRKY转录因子在三七体内是否参与调控对病原菌的防卫反应尚不清楚,因此,本项目从三七中分离协同茉莉酸信号参与茄腐镰刀菌防卫反应的WRKY基因;分析其在正常生长的三七中、信号分子处理后以及茄腐镰刀菌侵染过程中的表达谱;并选择了响应茉莉酸且表达水平较高的三七PnWRKY9基因,对其进行结构和亚细胞定位分析、功能验证以及对三七防御素基因PnDEFL1的转录调控特性研究。本论文的开展将有助于进一步了解三七WRKY转录因子协同茉莉酸信号参与对茄腐镰刀菌的防卫反应机制,深入认识三七与根腐病菌的分子互作机制。本文的研究内容和研究结果总结如下:1、通过转录组测序技术获得三七WRKY基因家族序列,并克隆得到30个具有完整ORF框的三七WRKY基因,将其命名为PnWRKY1-PnWRKY30。对这些基因进行保守结构分析、系统发育树分析、茉莉酸甲酯信号分子处理后茄腐镰刀菌侵染过程的表达谱分析。结果表明三七WRKY基因家族具有完整的保守结构域,在进化过程中高度同源。PnWRKY5/6/9/11/15/21/22/25/28/30等10个WRKY基因响应茉莉酸甲酯处理,并在茄腐镰刀菌侵染过程中转录水平上升。2、选取响应表达水平较高的PnWRKY9基因进行深入的功能研究。序列分析发现该基因含有一个WRKY结构域和一个CTYQGCX23HTH锌指结构域;构建PnWRKY9与GFP的融合表达载体,将其转化至根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105感受态细胞中,在洋葱表皮细胞中瞬时表达,激光共聚焦显微镜下观察PnWRKY9蛋白的定位位置,结果表明PnWRKY9蛋白定位在细胞核中。构建了p CAMBIA2300s-PnWRKY9植物超表达载体转化至WT烟草中稳定表达,获得PnWRKY9转基因烟草,并进行抗性分析,结果表明PnWRKY9转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性明显提高。随后又构建了PnWRKY9的RNAi表达载体将其转化至三七叶片中瞬时表达,并接种茄腐镰刀菌,结果显示RNAi载体表达的三七叶片增强了对茄腐镰刀菌的敏感性。功能验证分析表明,PnWRKY9是三七应对茄腐镰刀菌侵染的正调控因子。3、为验证PnWRKY9是调控三七抗性相关基因的转录因子,克隆了三七防御素基因PnDEFL1的启动子PPnDEFL1。该启动子含有一个W-box,进而采用凝胶阻滞（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）、酵母单杂交（yeast one hybrid,Y1H）分析PnWRKY9对PPnDEFL1的结合以及转录激活。构建了PnWRKY9的原核表达载体,通过异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导外源蛋白表达,并用Ni-NTA柱亲和层析法纯化出PnWRKY9重组蛋白,用于EMSA实验,结果显示PnWRKY9蛋白能与含有W-box的PPnDEFL1片段特异性结合;构建了PnWRKY9猎物载体和PPnDEFL1启动子诱饵载体,共同转化至酵母感受态细胞中用于YIH实验,结果表明,PnWRKY9转录因子具有转录激活特性;同时还构建了启动子与GUS基因表达融合载体,分别转化至过表达PnWRKY9的转基因烟草和WT烟草中表达,并测定转基因烟草的GUS活性,结果表明,PPnDEFL1与PnWRKY9共表达烟草的GUS活性明显强于PPnDEFL1单表达转基因烟草的GUS活性。可见PnWRKY9转录因子能转录激活PnDEFL1基因的启动子,正调控PnDEFL1的表达水平。三七WRKY是协同茉莉酸信号途径参与对茄腐镰刀菌防卫反应的重要转录因子基因,其中有10个基因响应茉莉酸甲酯的处理,并在茄腐镰刀菌侵染过程中转录水平上升。PnWRKY9是细胞核定位蛋白,特异结合根腐病抗病基因PnDEFL1的启动子序列,并正调控PnDEFL1的转录水平。PnWRKY9响应茉莉酸信号,正调节防御素基因的表达,在三七对茄腐镰刀菌防卫反应中起重要的调控作用。