传染性脾肾坏死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV)属于虹彩病毒科，肿大细胞病毒属。是可以导致鳜鱼、美国红鱼等名贵水产鱼类大批死亡的重要病源之一，近年来造成了严重的经济损失。为了研制其基因工程疫苗，控制该病毒的流行，通过生物信息学软件分析，在ISKNV基因组中筛选了2个可能编码囊膜蛋白的开放读码框(OpenReadingFrame，ORF)ORF24和ORF50。 根据GenBank上ORF24和ORF50的核苷酸序列，分别设计了一对特异性引物，采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了两个基因。将这两个基因连接到原核表达载体pET32a(novagen)，构建了重组表达载体pET32a-24和pET32a-50，再将其转化大肠杆菌BL21进行融合表达，融合蛋白VP24分子量约为50.6KD，VP50约为31.1kD，经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定，证实了BL21正确表达了目的蛋白。表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在，提取的包涵体中融合蛋白含量占50％以上，经柱层析纯化蛋白，纯化度达90％以上。 以SDS-PAGE纯化的两种融合蛋白作抗原，分别免疫新西兰兔制备多克隆抗体。ELISA检测两种抗血清效价达1:11000。Western-blot检验，两种抗血清中的IgG都能与目的蛋白发生特异性反应。 从病鱼组织中提取ISKNV病毒粒子。利用葡萄球菌pansorbine能吸附抗血清中的IgG，辅助抗原抗体特异性结合的特性，检测两种多克隆抗体是否能与病毒囊膜特异性结合，从而证明相应基因的功能。结果ORF50编码囊膜蛋白。 将重组菌BL21/pET32a-24和pET32a-50表达的融合蛋白制备成疫苗，给鳜鱼注射进行主动免疫。阴性对照组注射PBS不攻毒，阳性对照组不免疫(以下同)。两种蛋白的为混合疫苗免疫鳜鱼效果最好，最后疫苗组相对存活率(relativepercentagesurvival，RPS)有75％。同时，阴性对照组无死亡，而阳性对照组全部死亡(以下同)。 被动免疫，先注射多克隆抗血清24小时后再注射病毒液，RPS60％；先注射病毒液24小时后再多克隆抗血清，RPS20％。中和实验，将两种兔抗融合蛋白血清与病毒液1:1:1比例混合，常温孵育10-15分钟后，注射鳜鱼，RPS为80％。 对广东南海2000尾池养鳜鱼进行ISKNV基因工程疫苗中试，免疫方法和主动免疫相同。随即抽取20尾攻毒，RPS有70％。免疫实验表明所制备的疫苗对ISKNV感染有较强的抑制作用。 发酵罐大规模表达融合蛋白实验结果，5L规模的发酵罐，采用LB培养基，终浓度1mMIPTG诱导表达，37℃培养4-5小时，最后可制备融合蛋白包涵体8g左右。