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病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)是指携带一段植物功能基因cDNA的病毒载体侵染植物后诱导植物功能基因发生沉默,通过产生的表型或生理指标变化来反映该基因功能的一种方法。本文利用烟草曲茎病毒(TbCSV)DNA1卫星构建了一种新型的基因沉默载体2mDNA1。该载体能与同源辅助病毒一起侵染烟草植物,可以抑制转基因GFP和内源基因Su的表达,产生明显的表型突变。利用2mDNA1还可以与异源双生病毒中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)在植物上建立有效的基因沉默体系。该体系不仅可以抑制转基因GFP的表达,也可以抑制内源基因Su的表达,并且不产生任何的病毒症状。它可以诱导分生组织特异性表达和胚胎致死的pCNA基因发生沉默;可以在矮牵牛花上沉默CHS基因;并且该体系也可以同时抑制两个基因的表达;在该载体上插入170 bp-1155 bp的片段都可以诱导有效的基因沉默;此外,它在所有已测定的6种寄主植物都能诱导高效的基因沉默。因为DNA1能够与不同的辅助病毒相伴随,扩大了DNA1的寄主范围,使得DNA1能够在更多的寄主上进行功能基因的研究。利用2mDNA1和TbCSV对其在普通烟中的沉默体系进行了优化,优化后的沉默体系不仅能够高效沉默转基因普通烟,也能在多个普通烟品种中高效沉默植物内源基因Su,并且沉默效果持久,沉默可以在18-32℃温度下诱导。利用DNA1沉默载体,开展了基因功能的研究。从本氏烟扩增到TOM类寄主因子NbTOM1和NbTOM3的基因片段,通过沉默研究证明NbTOM1和NbTOM3的沉默能够降低TMV的复制,但是只有同时沉默NbTOM1和NbTOM3两个基因才能够完全抑制TMV的复制,表明NbTOM1和NbTOM3是TMV复制所需的寄主因子。利用TbCSV和2mDNA1研究了普通烟NtEDS1基因在N基因介导的抗TMV中的作用。当MEDS1被沉默后,TMV在含N基因普通烟中不再产生过敏性反应(HR),而表现出TMV系统侵染的病毒症状。证明了NtEDSl在TMV诱导的HR反应中有着重要作用,这是利用VIGS在普通烟中研究抗病相关基因的首次报道。利用2mDNA1和TYLCCNV的沉默体系初步研究了本氏烟中叶片发育相关基因NbPHAN的功能。当NbPHAN被沉默后叶片发育产生明显的改变。叶片背腹极性改变,叶片皱缩、下卷并在叶片上表面产生耳突。全基因比对发现NbPHAN是典型的ASl/PHAN类的基因,包含保守的MYB核酸结合域以及C端的CTD结构域。酵母双杂交试验发现NbPAHN和AtAS1一样,能够和拟南芥中的AtAS2互作,决定这种互作的氨基酸位于NbPHAN的中间区域;NbPHAN也能够自我互作并且保守的C端CTD域决定了这种互作。NbPHAN定位在核仁内,并且基因MYB结构域决定了该基因的亚细胞定位。下一步将继续研究NbPHAN基因在致病性中的作用。