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研究背景与目的:肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一,在所有癌症的发病率和死亡率中,肺癌始终位于前列。在我国肺癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病率的首位和第二位,而男女恶性肿瘤死亡率最高的均为肺癌。肺癌对人类的健康已经构成了严重的威胁。因此人们在重视手术治疗、放疗、化疗等传统治疗手段的同时,也在积极探寻新的疗法。肿瘤基因治疗近年来作为癌症治疗研究的新热点得到不断发展。其中RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种从低等植物到高等哺乳动物普遍存在的生物学现象,是由小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)引导的靶mRNA降解的转录后基因沉默。通过RNA干扰对关键基因的沉默作用,可以抑制致病核酸的表达或者异常蛋白的合成。与其他基因治疗手段相比,RNA干扰技术显示出高效性、特异性、便捷性等优越之处,正在引领基因治疗的新潮流,具有可观的应用前景。基因治疗需要有效的靶位点,因此筛选有效的基因治疗靶点十分重要。已知端粒酶活性几乎在绝大多数人类恶性肿瘤中都可以检测到,而在几乎所有的成人体细胞中呈现阴性,因此与恶性肿瘤之间有很高的相关性。端粒酶的高活性在肺癌的发生、发展中有亦有着重要作用,其催化亚基端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶活性和肿瘤发展中的决定性因子,因而有望成为肺癌基因治疗的理想靶点。本研究利用实时荧光定量PCR技术对肺癌细胞中的hTERT mRNA表达进行定量分析,筛选出相对表达量最高的肺癌细胞株95D。将化学合成的siRNA转染入95D细胞中,探讨针对hTERT的特异性siRNA介导的RNA干扰对肺癌细胞中hTERT基因表达的沉默及对肺癌细胞增殖的抑制作用。研究内容和方法:1.优化PCR条件,通过Real Time RT-PCR技术检测人肺癌细胞系L78、NCI-H520、A549、LTEP-α-2、NCI-H460和95D中hTERT mRNA的相对表达量。2.根据hTERT基因序列和siRNA设计原则,设计并化学合成三对siRNA,将siRNA转染入hTERT mRNA高表达的肺巨细胞癌细胞95D中,应用Real Time RT-PCR技术检测转染后hTERT mRNA表达水平变化情况。3.流式细胞术检测hTERT siRNA转染后所介导的RNA干扰作用对于肺癌细胞凋亡水平的诱导和影响。4. MTT法检测hTERT siRNA对于肺癌细胞生长、增殖能力的抑制作用。结果:1.目的基因和内参照基因的PCR产物片段大小均与预计值一致,说明各细胞中RNA提取及RT-PCR过程均良好。Real Time RT-PCR结果表明hTERT mRNA在多个肺癌细胞系中均高表达,其中在肺巨细胞癌95D中相对表达量最高。以95D为实验对象进行RNA干扰研究。2. hTERT siRNA转染95D细胞48小时后(转染浓度为100nmol/L),与空白脂质体对照组和阴性对照组比较,siRNA-1和siRNA-2均明显抑制了hTERT mRNA表达(P值均小于0.01),抑制率分别为77.33±5.13%和50.67±8.02%,siRNA-3抑制率较低,仅为27.67±10.26%。3.选取抑制效果最显著的hTERT siRNA-1对95D肺癌细胞进行由低到高3个浓度的转染,转染浓度分别为50nmol/L,80nmol/L,100nmol/L。50nmol/L浓度转染组与阴性对照组之间hTERT mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)。80nmol/L组、100nmol/L浓度转染组分别与阴性对照组比较,hTERT mRNA表达量差异均有统计学意义(P值均小于0.01) ,而这两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。4.转染48h后,与空白脂质体对照组比较,50nmol/L、80mol/L、100nmol/L浓度的hTERT siRNA-1转染组细胞凋亡率均显著增加(P值均小于0.01)。与阴性对照组比较,50nmol/L浓度转染组的细胞凋亡率无显著增加(P>0.05),而80nmol/L、100nmol/L组细胞凋亡率显著增加(P值均小于0.01)。空白脂质体对照组与阴性对照组比较亦有显著差异(P<0.05)。5. MTT检测结果显示,转染12小时后肺癌细胞增殖抑制作用开始显现,但效果尚弱,24小时已较明显,48小时最显著,72小时抑制效果转弱。hTERT siRNA可以有效抑制肺癌细胞增殖,抑制效应具有时间依赖性。结论:1.人肺癌细胞系L78、NCI-H520、A549、LTEP-α-2、NCI-H460和95D中hTERT mRNA均高表达,其中肺巨细胞癌细胞95D相对表达量最高。为下一步进行的RNA干扰实验研究的细胞模型的选择奠定了基础。2.有效设计并合成了特异性针对hTERT的siRNA,可以有效下调肺巨细胞癌细胞95D的端粒酶hTERT mRNA表达,从而抑制端粒酶活性、诱导肺癌细胞凋亡,抑制肺癌细胞增殖。