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佐剂（Adjuvant）是一类可提高疫苗免疫效力的非特异性免疫增强剂。其中新型核酸佐剂是以具有免疫刺激活性的核酸片段为主要成分的新型佐剂,因其安全、免疫增强作用高效的特点而广受关注。然而,目前新型核酸佐剂的研究主要聚焦于单一种属动物特异的免疫刺激序列,对于多种属动物具有广谱免疫增强优势的新型核酸佐剂的研究尚少。为筛选出对猪PBMC具有增殖优势的免疫刺激序列,本研究通过猪淋巴细胞转化实验,采用CCK-8法检测了本实验室前期构建的7种携带不同免疫刺激序列的重组质粒（分别为pc DNA3.1-1～7）对猪外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的刺激增殖作用。结果显示,重组质粒pc DNA3.1-6对猪PBMC的刺激增殖效果高于其他质粒,刺激细胞增殖的效果与质粒的量呈正相关。为进一步分析重组质粒pc DNA3.1-6刺激对猪PBMC免疫分子的影响,本研究采用q RT-PCR的方法分析了重组质粒pc DNA3.1-6对猪PBMC TLR9信号途径的关键分子髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor 88,My D88）及其下游细胞因子转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）、白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）和白细胞介素-12（Interleukin-12,IL-12）m RNA水平的影响。结果显示,重组质粒pc DNA3.1-6可显著上调猪PBMC My D88和IL-12 m RNA水平,下调TGF-β和IL-10m RNA水平,表明重组质粒pc DNA3.1-6可能通过TLR9信号途径促进猪PBMC Th1型细胞因子表达,抑制Th2型细胞因子表达。上述实验表明,本研究筛选出的重组质粒pc DNA3.1-6是对猪PBMC具有免疫增强优势的核酸序列。结合本实验室前期研究发现:7种重组质粒中重组质粒pc DNA3.1-6同样对鸡PBMC具有增殖增强优势,提示对鸡和猪均具有较强免疫刺激作用的重组质粒pc DNA3.1-6可作为重点研究对象。为筛选可高效稳定制备重组质粒pc DNA3.1-6的优势菌株,本研究将该质粒分别转化至大肠杆菌DH5α和大肠杆菌JM110中进行同条件培养,通过商品化试剂盒提取质粒,计算分析质粒获得量。结果显示,大肠杆菌DH5α宿主菌所得质粒约是大肠杆菌JM110宿主菌的2.5倍。本研究将重组质粒pc DNA3.1-6转化至大肠杆菌DH5α中,连续划线传代培养50代,每5代测序鉴定其遗传稳定性。结果显示,重组质粒pc DNA3.1-6在DH5α宿主菌中50代内无突变缺失现象。表明重组质粒pc DNA3.1-6可在大肠杆菌DH5α中稳定遗传。上述实验表明,大肠杆菌DH5α可作为重组质粒pc DNA3.1-6高效稳定制备的工程菌株。本研究在碱裂解的原理基础上,优化质粒提取步骤得简化法,简化法提取重组质粒pc DNA3.1-6的产物称为新型核酸佐剂pc DNA3.1-6。为评价新型核酸佐剂pc DNA3.1-6对禽用疫苗的免疫增强作用,本研究将新型核酸佐剂pc DNA3.1-6和商品化试剂盒法提取的重组质粒pc DNA3.1-6分别与H9亚型禽流感灭活疫苗联合免疫40日龄清远麻鸡,同时设立H9亚型禽流感灭活疫苗组和空白对照组。免疫后第7、14、21、28和35天采集各组鸡的翅下静脉血液分离血清,采用HA-HI方法检测H9亚型禽流感病毒抗体效价。结果显示,新型核酸佐剂pc DNA3.1-6和商品化试剂盒法所得的重组质粒pc DNA3.1-6分别与H9亚型禽流感灭活疫苗联用组的抗体效价均显著高于H9亚型禽流感灭活疫苗组,不同时间点新型核酸佐剂pc DNA3.1-6与H9亚型禽流感灭活疫苗联用组的抗体效价均高于商品化试剂盒法所得的重组质粒pc DNA3.1-6与H9亚型禽流感灭活疫苗联用组。结果表明,重组质粒pc DNA3.1-6可显著增强H9亚型禽流感灭活疫苗的抗体效价;新型核酸佐剂pc DNA3.1-6免疫增强作用优于商品化试剂盒所得的重组质粒pc DNA3.1-6。为评价新型核酸佐剂pc DNA3.1-6对猪用疫苗的免疫增强作用。本研究选取猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗与新型核酸佐剂pc DNA3.1-6联用免疫2月龄猪,同时设立猪O型口蹄疫病毒多表位病毒疫苗组和空白对照组,在首次免疫后第28天加强免疫。首免后第14、21、28、35和42天,采集猪前腔静脉血分离血清,用ELISA方法检测抗体水平。结果显示,在不同时间点,新型核酸佐剂pc DNA3.1-6和猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗联用组的抗体水平均高于猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗组;首免后第35天,实验组抗体水平均达最高,新型核酸佐剂pc DNA3.1-6和猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗联用组的抗体水平比猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗组高25%。结果表明,新型核酸佐剂pc DNA3.1-6可显著提高猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗的抗体效价。综上所述,本研究成功筛选出对猪PBMC具有增殖优势的重组质粒pc DNA3.1-6,确定了大肠杆菌DH5α为重组质粒pc DNA3.1-6的优势工程菌株,证明了简化法所得新型核酸佐剂pc DNA3.1-6可显著增强H9亚型禽流感灭活疫苗和猪O型口蹄疫病毒多表位疫苗的抗体效价,为后续该新型核酸佐剂的应用提供了理论基础和技术支撑。