目的近年来，抗肿瘤血管生成已成为肿瘤治疗的基础和临床研究热点，是最有希望的肿瘤导向治疗靶标。与传统的肿瘤治疗相比，抗肿瘤血管生成治疗的最大特点在于它不但具有良好的特异性，而且克服了药物达到肿瘤组织的不足和肿瘤耐药性等问题。我国的中医药治疗与血管生成相关的病症有着悠久的历史，具有不同于西医的特殊性，并在这些病症的治疗上有极大的优势。因此，研究中药抗肿瘤血管生成，在阐明中医基础理论、临床治疗及中药研究中具有十分重要的意义。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，是姜黄的主要成分，也是咖喱、芥末中的主要黄色色素，属于天然酚类抗氧化剂，姜黄素作为抗突变剂和抗促癌剂，具有安全、无显著副作用的特点，美国国立肿瘤所已将其列为第三代癌化学预防药。姜黄素的抗肿瘤机制是多方面的，其中抑制肿瘤新生血管的生成是姜黄素抗肿瘤作用的重要机制。研究证明姜黄素下调埃列希腹水肿瘤细胞(EAT)血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达，减少细胞中VEGF的水平是姜黄素抑制肿瘤血管生成的作用机制。VEGF是肿瘤诱导产生新生血管最主要的细胞因子。而肝癌为富含血管的肿瘤，且VEGF在肝癌中有高表达，那么，姜黄素是否抑制人肝癌细胞BEL-7402中VEGF蛋白和mRNA的表达，值得我们深入探讨。肿瘤最主要的特征是肿瘤细胞的失控性生长，不断增多的细胞数将导致耗氧量的增加，造成肿瘤内缺氧微环境的形成，如果肿瘤继续生长，就必须建立一套血管供应系统进行持续的氧气和营养物质的供应。其中最重要的是缺氧诱导因子-1(HIF-1)，它是调节氧稳态平衡的转录因子，由HIF-1α和HIF-1β亚基组成的，HIF-1α是唯一的氧调节亚单位，决定HIF-1的活性。HIF-1直接调控VEGF基因的表达，是恶性肿瘤诱导新生血管形成的主要调控因子，那么HIF-1α在姜黄素抑制肝癌细胞BEL-7402中扮演什么角色，目前需进一步研究。正常情况下，HIF-1α在体内是多聚泛素，通过泛素-蛋白酶体途径显示快速降解，在缺氧情况下，HIF-1α泛素明显减少，引起HIF-1α蛋白增加。HIF-1α在降解过程中，p53也通过Mdm-2调节泛素和26S蛋白酶体起促进作用。蛋白酶体和p53是否参与姜黄素抑制HIF-1α蛋白的表达作用中，还需我们进一步研究。有国外学者研究证实丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)或磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号传导通路介入HIF-1α和VEGF的调节中，那么，MAPK和PI3K信号传导通路是否介入姜黄素对HIF-1α和VEGF的表达作用中，目前国内外尚未见报道。本研究的主要目的有：(1)观察姜黄素对人肝癌细胞BEL-7402中VEGF表达的影响；(2)观察姜黄素对人肝癌细胞BEL-7402中HIF-1α表达的影响；(3)应用蛋白酶体抑制剂MG132和野生型p53阴性的人肝癌细胞株Hep3B，观察蛋白酶体和p53在姜黄素对HIF-1α蛋白表达中的作用；(4)应用PI3K抑制剂LY294002、MEK抑制剂U0126、mTOR／FRAP抑制剂rapamycin，观察PI3K和MAPK信号传导通路在姜黄素对VEGF、HIF-1α表达中的作用，从而进一步揭示姜黄素抑制肿瘤血管生成的作用机制。方法1．姜黄素对人肝癌细胞BEL-7402中VEGF、HIF-1α表达的影响(1)以不同浓度的姜黄素作用人肝癌细胞BEL-7402缺氧环境中培养6小时。(2) 10μmol／L的姜黄素处理人肝癌细胞BEL-7402缺氧培养0-8小时，均采用WST-8法和台盼蓝染色法分析细胞增殖和活力，RT-PCR和Western Blot方法检测人肝癌细胞中VEGF、HIF-1α的表达；统计学处理行t检验分析。2．蛋白酶体和p53参与姜黄素对人肝癌细胞BEL-7402中HIF-1α蛋白的抑制作用(1) 0、10μmol／L姜黄素、10μmol／L MG-132、10μmol／L姜黄素+10μmol／LMG-132作用人肝癌细胞BEL-7402缺氧环境中培养6小时。(2)不同浓度的姜黄素作用人肝癌细胞BEL-7402、Hep3B，缺氧环境中培养6小时，均采用WST-8法和台盼蓝染色法分析细胞增殖和活力，Western Blot方法检测人肝癌细胞BEL-7402、Hep3B中HIF-1α蛋白的表达：统计学处理行t检验分析。3．MAPK和PI3K信号传导通路在姜黄素调节HIF-1α和VEGF表达中的作用(1)在放入接种过人肝癌细胞BEL-7402盖玻片的6孔板中，分别加入0、10μmol／L姜黄素，缺氧环境中培养6小时，行细胞免疫化学染色检测VEGF和HIF-1α蛋白表达。(2)分别加入LY294002 25μmol／L、50μmol／L，U0126 10μmol／L、20μmol／L，rapamycin 5ng／ml、10ng／ml处理的人肝癌细胞BEL-7402，30分钟后加入姜黄素10μmol／L，对照组单独加入0、10μmol／L姜黄素，缺氧环境中培养6小时后，行RTPCR和Western Blot检测VEGF蛋白、mRNA和HIF-1α蛋白表达。(3)分别加入不同浓度的的姜黄素以及LY294002 25μmol／L处理的人肝癌细胞BEL-7402，缺氧环境中培养6小时后，行Western Blot检测磷酸化AKT和总AKT蛋白表达；统计学处理行t检验分析和Pearson相关分析。结果1．姜黄素对人肝癌细胞BEL-7402中VEGF、HIF-1α表达的影响(1)不同浓度的姜黄素作用的人肝癌细胞BEL-7402，缺氧环境中培养6小时，细胞增殖率和细胞活性与正常对照组相比无显著性差异，P＞0.05；VEGF蛋白、mRNA表达逐渐降低，与对照组相比呈显著性差异，P＜0.01；HIF-1α蛋白表达逐渐降低，与对照组相比呈显著性差异，P＜0.01，HIF-1αmRNA表达与对照组相比无显著性差异，P＞0.05。(2) 10μmol／L的姜黄素处理人肝癌细胞BEL-7402缺氧培养0-8小时，细胞增殖率和细胞活性与正常对照组相比无显著性差异，P＞0.05；VEGF蛋白、mRNA表达逐渐增加，与对照组相比呈显著性差异，P＜0.01；HIF-1α蛋白表达逐渐增加，与对照组相比呈显著性差异，P＜0.01，HIF-1αmRNA表达与对照组相比无显著性差异，P＞0.05。2．蛋白酶体和p53参与姜黄素对人肝癌细胞BEL-7402中HIF-1α蛋白的抑制作用(1) 10μmol／L姜黄素处理的人肝癌细胞BEL-7402缺氧6小时后HIF-1α蛋白表达与MG-132+姜黄素组相比降低，10μmol／L MG-132组HIF-1α蛋白表达与MG-132+姜黄素组相比降低，10μmol／L姜黄素组HIF-1α蛋白表达与0μmol／L姜黄素组相比降低，10μmol／L MG-132组HIF-1α蛋白表达与0μmol／L姜黄素组相比增加，均呈显著性差异，P＜0.01。(2)不同浓度姜黄素处理的人肝癌细胞Hep3B缺氧6小时后HIF-1α蛋白表达与对照组相比无显著性差异，P＞0.05；不同浓度的姜黄素处理的人肝癌细胞BEL-7402缺氧6小时后HIF-1α蛋白表达与对照组相比下降，并呈显著性差异，P＜0.01。3．MAPK和PI3K信号传导通路在姜黄素调节HIF-1α和VEGF表达中的作用(1)在缺氧条件下，姜黄素对人肝癌细胞BEL-7402中HIF-1α和VEGF蛋白表达较对照组明显降低，HIF-1α和VEGF蛋白表达呈正相关，r=0.965，P＜0.01。(2)姜黄素10μmol／L+LY294002 25μmol／L组、姜黄素10μmol／L+LY294002 50μmol／L组、姜黄素10μmol／L+rapamycin 5ng／ml组、姜黄素10μmol／L+rapamycin 10ng／ml组HIF-1α蛋白、VEGF蛋白、mRNA表达分别与姜黄素10μmol／L组相比降低，有显著性差异，P＜0.01；而姜黄素10μmol／L+U0126 10μmol／L组、姜黄素10μmol／L+U0126 20μmol／L组HIF-1α蛋白、VEGF蛋白、mRNA表达分别与姜黄素10μmol／L组相比无显著性差异，P＞0.05。(3)不同浓度的姜黄素、LY294002 25μmol／L处理的人肝癌细胞BEL-7402缺氧6小时后磷酸化AKT蛋白表达逐渐降低，LY294002 25μmol／L基本阻断磷酸化AKT蛋白的表达，而对总AKT蛋白表达无明显变化，同时LY294002 25μmol／L也不能阻断总AKT蛋白表达。结论(1)姜黄素抑制人肝癌细胞BEL-7402中VEGF的mRNA和蛋白表达。(2)姜黄素抑制人肝癌细胞BEL-7402中HIF-1α蛋白的表达不通过细胞死亡或抑制细胞增殖途径，而是通过转录后机制。(3)姜黄素抑制人肝癌细胞BEL-7402中HIF-1α蛋白表达通过p53和蛋白酶体途径。(4)姜黄素抑制人肝癌细胞BEL-7402中VEGF的产生可能通过抑制HIF-1α蛋白的表达实现的；姜黄素抑制人肝癌细胞BEL-7402中HIF-1α蛋白和VEGF的表达通过PI3K／AKT／FRAP信号传导通路，且姜黄素抑制人肝癌细胞BEL-7402中磷酸化Akt，而对总Akt无变化。