对于健康个体而言，真菌一般是条件致病菌，当机体抵抗力下降、外界一些因素作用，有可能造成全身或局部真菌感染。按国际医学界的通用标准，真菌按最初感染时的部位分为3种类型：浅表性真菌病、皮下真菌感染和系统性真菌感染。咪康唑是高效、安全、广谱的抗真菌药，对致病性真菌几乎都有作用。其机理是抑制真菌细胞膜的固醇合成，影响细胞膜通透性，抑制真菌生长，导致死亡。在4微克/毫升以下的浓度可抑制大部分临床分离的真菌，其中新型隐球菌，念珠菌和粗孢子菌对本品均敏感，皮炎芽生菌和组织胞浆菌对本品高度敏感，但曲霉菌较差。另外，咪康唑对金葡菌和链球菌及革兰阳性球菌和炭疽菌等也有抗菌作用。硝酸咪康唑乳膏常见的外用制剂，临床偶尔也用于静脉滴注，但是副作用大，有肝毒性甚至能引起心脏骤停。此外，由于长期大量使用抗真菌药物，真菌对药物的敏感性下降，咪康唑所针对的真菌也不例外。临床上常用于提高耐药真菌治疗效果的方法有：增大剂量，改变药物类型，两药或多药协同。两药协同有很多优势，如降低其中毒性较大药物的剂量，提高药物治疗效果，增加抗真菌谱，延缓真菌耐药性产生等。天然产物物种丰富，可作为抗真菌药物增敏剂的来源之一，一般选取结构明确的单体做研究。小檗碱又称黄连素，是一种常见的异喹啉生物碱，存在于小檗科等四个科十个属的许多植物中，资源丰富。小檗碱具有抗菌，解热抗炎，调节血脂，治疗糖尿病等药理活性，并且安全性高。实验室前期研究中已发现小檗碱与多种抗真菌药物有协同作用，并且已对小檗碱与氟康唑的协同机制作了研究。咪康唑与小檗碱的协同作用研究，前期已做过体内实验，确定有效果，并且浓度已确定为：咪康唑1.5%，小檗碱1.5%联合作用效果最好。本课题主要目的是研究小檗碱与咪康唑协同抗耐药白念珠菌作用及作用机制。分为四大部分。第一部分，通过棋盘式微量稀释法确定对咪康唑不敏感的白念珠菌及咪康唑与小檗碱联合作用于白念珠菌的浓度，通过spot assay、生长曲线进一步验证并摸索出后续研究中的最适浓度。实验选取白念珠菌18为研究对象，微量稀释法测定MCZ2μΜ,BBR1μΜ时就有很好的协同作用，Spot aasay中联合作用MCZ2μΜ时,BBR16μΜ以上协同作用效果较好，生长曲线结果表明，MCZ2Μμ,BBR64μΜ协同作用效果稳定，故根据第一部分实验结果，选取MCZ2μΜ,BBR64μΜ作用于白念珠菌18作后续研究。第二部分，通过实验室前期已构建的平台来研究两药协同作用，主要方法有，透射电镜观察药物对白念珠菌超微结构的影响，流式细胞仪测定细胞周期观察药物对细胞周期的影响，罗丹明外排实验测定白念珠菌CDR1外排泵功能，GC-MS测定药物作用下麦角甾醇含量的变化，用POLARstar多功能微板检测仪检测细胞内活性氧（ROS）的产生量。超微结构观察，高浓度咪康唑作用下的细胞形态变化较大，尤其是细胞壁部分，变薄消失得更明显，并且有很多小核出现，出现空泡，而低浓度咪康唑与小檗碱联合作用时细胞壁与单用药类似，但不同的是，细胞中靠近细胞膜的地方有大量不明物质聚集，并且与细胞质界线分明伴随胞浆出现肿胀现象。细胞周期实验中两药合用能引起细胞周期阻滞于S期，咪康唑高浓度组无该现象。活性氧测定实验中，两药合用降低活性氧的产生量，但显著多于空白对照组。麦角甾醇测定实验中两药合用也能引起与咪康唑单用相同的羊毛甾醇累积，并且两药合用引起的羊毛甾醇累积多余咪康唑单用组，并有显著差异。不同的是合用后麦角甾醇含量又所上升，但没显著差异。综上实验，本部分作如下解释推测：咪康唑对白念珠菌有杀伤作用，但白念珠菌自身有一套保护机制，如耐药蛋白对药物的外排，部分白念株菌能被咪康唑杀伤，但有部分不能杀伤，甚至产生变异，从而对咪康唑耐药性进一步加强，临床上的超级耐药菌产生的部分原理与此相同。小檗碱对白念珠菌有一定的保护作用，推测，两药联合作用时，加入小檗碱表面上能减少咪康唑的直接杀伤损害真菌细胞的作用，但是却增加真菌细胞不可逆转的慢性损伤，使对真菌细胞的杀伤损害作用稳定而持久，这也是两药联合优于咪康唑高浓度的优势之一。小檗碱与咪康唑两药联合不仅能降低高浓度咪康唑引起的毒性，而且二者的杀菌效果较高浓度咪康唑更有优势。第三部分，药物体内作用效果研究，主要是实验室前期研究工作的后续，在前期已有工作基础上，进行实验重复验证，并进一步通过病理切片观察药物对豚鼠感染皮肤的作用。虽然实验后期豚鼠表面痊愈情况相差无几，但是从病理切片结果来看，联合用药组可以杀灭豚鼠皮下组织中残留的真菌，这可以很好的防止真菌感染后反复性发作。第四部分，主要是方法学研究，在测定活性氧过程中发现一些存在问题，通过文献调研，发现使用DCFH-DA测定细胞内活性氧虽有很大优势，如简便定量等，但其测定活性氧过程中受很多因素影响，文献中已对光照、实验时溶剂的pH值等做过研究，但鲜有人研究化合物对其作用的影响。而本实验室测定活性氧的实验有很大一部分是建立在在化合物作用下活性氧产生的改变量，并且文献中也有此类应用，故第四部分主要研究化合物对染料测定荧光值得影响，研究证明，不同化合物对染料及染料水解后会有不同的影响。从文献及实验结果来看，使用DCFH-DA作为测定活性氧染料需要有以下注意事项：1.实验过程中须做好避光工作；2.染料需用乙醇溶解；3.溶剂酸碱性为中性或偏碱性时，染料孵育时间尽量缩短；4.一定要设置单纯药物与染料在溶剂中相互作用的对照组；5.染料对细胞本身有一定损害作用，故其浓度不能太高；6.测定过程中所显示的荧光强度对温度敏感，故实验须在相同条件下进行；7.使用酶标仪测定活性氧时，需要细胞计数以尽量保证所测结果的客观程度，并且在测量和染料孵育前要进行洗涤，最好能再结合荧光显微镜观察或者流式细胞仪测定的结果。8. DCFH-DA测定活性氧的结果不能作为精准确定活性氧产生量的结果，只能参照该结果。