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M电流是广泛存在于神经系统的一种钾电流,是影响神经元兴奋性的主要机制之一,是唯一在神经元阈电位附近激活的电流,它的功能降低可以引起神经元兴奋性增高,诱发癫痫等疾病。众多神经递质和神经肽可以调节M电流进而影响神经元兴奋性。近年来,对神经递质等调节M电流的分子机制有了很大进展,其中以乙酰胆碱激活M型胆碱受体（M1）和缓激肽激活其II型缓激肽受体（B2受体）后调节M电流的分子机制最有代表性。虽然两种受体激活都可以抑制M电流,但其分子机制有所不同,其中对细胞内Ca2+浓度影响的不同是关键之处。然而,对于造成这一不同的进一步机制则有待进一步研究。本实验试图从细胞膜脂筏（lipid raft）的角度来解释不同膜受体介导的细胞信号通路对M电流调节不同的机制。脂筏是细胞膜上的一种脂质微区,在大多数哺乳动物的细胞膜上都有分布,一般大小为55-300 nm,富含胆固醇和鞘磷脂,具有低浮力密度和不溶于去污剂的特性。近期研究表明,脂筏在信号转导事件中发挥着重要的作用;脂筏中特异聚集的不同信号分子可能决定了不同信号转导通路的特异性。本研究将以与M1受体、B2受体以及所相关的细胞信号分子在脂筏中分布的异同为中心,观察脂筏在M电流的特异性调节中的作用。目的:研究大鼠颈上神经节神经元细胞膜脂筏在膜受体特异调节M电流中的作用方法:1脂筏提取及脂筏中膜蛋白的鉴定1.1蔗糖密度梯度离心法分离脂筏及脂筏的鉴定摘取40只7天SD大鼠SCG,用玻璃匀浆器进行匀浆,离心5000 rpm,5 min。取上清。将约1.5 ml上清置于8.9 ml离心管底部,加入80%蔗糖1.5 ml,轻轻混匀避免气泡的产生,在液面上方缓慢加入3 ml 35%蔗糖,同法操作,再加入约3 ml 5%蔗糖,制备40%/35%/5%的蔗糖梯度。39,000 rpm,4℃,离心21 h。将离心后的液体从上到下连续取出九个部分,每部分约一毫升。从每个部分中取出4μl,均匀地点于尼龙膜上,进行Dot blots实验,利用霍乱毒素B测定神经节苷脂GM1在九个部分的分布情况,而GM1是脂筏的标记分子之一。1.2去污剂法分离脂筏摘取10只7天SD大鼠SCG,用玻璃匀浆器匀浆,离心5,000 rpm,10 min,取上清,40,200 rpm, 4℃,1 h。沉淀用200μl含500 mM Na2CO3及1% triton低渗匀浆Buffer悬浮并超声,冰上静置30 min,15,000 g, 4℃,30 min,分成去污剂溶解与不溶两种组分,然后用5×SDS-PAGE上样缓冲液变性。1.3 M1受体、B2受体及相关信号分子在膜脂筏中分布的鉴定将超速离心后的九部分及去污剂溶解部分与不溶部分经12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移至NC膜。膜用5%的脱脂奶粉常温下封闭1小时。分别加特异性的抗体孵育过夜。抗体有单克隆抗体caveolin-1（1:1000）, B2受体（1:1000）,多克隆抗体M1（1:200）,Gq（1:200）,G11（1:200）,PLCβ4（1:200）,PLCβ1（1:200）。然后用TBST洗膜液洗膜三次,每次10分钟。加相应的荧光二抗（1:4000）,室温孵育3-4小时。洗膜后用Odyssey9120双色红外激光成像系统显色分析。2 M电流记录分离培养颈上神经节神经元,打孔膜片钳记录M电流。将细胞钳制在-20 mV,然后复极化到-60 mV,记录膜电位在-60 mV时M电流的尾电流。比较甲基环糊精（MβCD）处理前后给予OXO-M （5μM）和BK（100 nM）后M电流的抑制情况。3细胞内Ca2+测定使用荧光探针Flu-4-AM（2.5 nmol/L）和透膜剂F127（0.02%）标记钙离子,室温孵育30分钟,使染料进入细胞。用0.01 M PBS清洗细胞三次,然后用激光共聚焦显微镜观察环糊精处理前后再给予缓激肽刺激时的细胞内钙离子的变化情况。4免疫细胞化学和免疫共沉淀4.1免疫细胞化学观察caveolin-1与B2受体和M1受体的共定位。将细胞用4%多聚甲醛固定后,用含0.2% Triton-100的PBS作用30分钟,增加通透性,然后加入特异性的一抗和荧光标记的二抗或三抗,用激光共聚焦扫描显微镜观察鼠cavolin-1与鼠B2受体和兔M1受体的共定位情况。4.2免疫共沉淀方法观察颈上神经节中IP3受体与B2受体之间的相互关系。摘取SCG组织并用玻璃匀浆器匀浆后,离心5000 rpm,10 min。取上清,加入2μl IP3抗体,4℃,60 rpm振摇过夜,次日加入protein G beads, 4℃,60 rpm,4 h后洗涤珠子,将纯化后的蛋白免疫复合物进行SDS-PAGE凝胶电泳,电转移至NC膜上,用脱脂奶粉封闭后,用B2抗体和荧光染料标记的二抗进行检测,显色结果用Odyssey9120双色红外激光成像系统扫描分析。结果:1在大鼠颈上神经节中有脂筏的存在,其特异性蛋白caveolin-1分布于蔗糖密度梯度离心分离组份的第3,4,5层（共9层）,且第4层含量最多。脂筏的另一标记物GM1分布于1-5层,其中在1-3层含量较多。2 B2受体、Gq、G11、PLCβ4和PLCβ1都在脂筏中有分布,而M1受体少见于脂筏中。3用1% triton X-100处理膜样品之后,在不溶解于去污剂的部分中通过Western blots可以检测到caveolin-1、B2受体、M1受体、PLCβ1、PLCβ4、Gq、G11的存在。就B2受体和M1受体而言, B2受体在去污剂不溶的部分中的比例高达83.9%,远高于M1受体的14.7%。其它在去污剂不溶的部分中的比例为:PLCβ4 19.7%,PLCβ1 18.6%,Gq 34%,G11 21.6%。在用5 mM MβCD处理1h后,B2受体在去污剂不溶的部分的含量降至原来的30%（P<0.05,n=3）。4 M受体激动剂OXO-M诱导的SCG神经元M电流抑制的百分率在给予MβCD前为82±6.3%,而在给予10 mM MβCD和5 mM MβCD分别为49±8.7%（与给MβCD前相比显著减少,P<0.01）和71±4.9%（与给MβCD前相比无显著差别,P>0.05）;而缓激肽BK诱导的M电流抑制的百分率在给予MβCD前为77±7%,而在给予MβCD 5 mM和10 mM MβCD后分别为32±8.5%（与给MβCD前相比显著减少,P <0.01）和37±8%（与给MβCD前相比显著减少, P <0.01）,表明BK诱导的M电流抑制对MβCD更敏感。5 5 mM MβCD处理SCG神经元后明显减弱BK诱导的细胞内钙升高,给予MβCD前后BK诱发的细胞内钙的变化率分别为128.3±3.1%和107.4±3.0%（P <0.01）。6在SCG神经元B2受体较之M1受体与caveolin-1有更多共定位现象。结论:1大鼠颈上神经节（SCG）组织细胞上存在脂筏微域,Ⅱ型缓激肽受体（B2）及其相关细胞信号通路分子如Gq、G11、PLCβ4和PLCβ1都在脂筏中有分布;M1受体可能不存在于脂筏中2脂筏在B2受体调节SCG神经元M通道功能中发挥重要作用3缓激肽受体（B2）激活后升高SCG神经元内钙需要脂筏的空间完整性4缓激肽受体（B2）与caveolin-1在SCG神经元有共定位