研究背景妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders in pregnancy)是妊娠期特有的疾病。发病率我国9.4%～10.4%,国外7%～12%。本病名强调生育年龄妇女发生高血压、蛋白尿症状与妊娠之间的因果关系。多数病例在妊娠期出现一过性高血压、蛋白尿症状,分娩后即随之消失。该病严重影响母婴健康,是孕产妇和围生儿发病率及死亡率的主要原因。妊娠期高血压疾病的分类,国内外存在不同的标准；根据乐杰主编的第七版妇产科学,将其分为五类：(1)妊娠期高血压(gestational hypertension),妊娠期首次出现BP≥140/90 mmHg,并于产后12周恢复正常,尿蛋白(-),少数患者可伴有上腹部不适或血小板减少,产后方可确诊。(2)子痫前期(preeclampsia)①轻度,妊娠20周以后出现BP≥140/90 mmHg,尿蛋白≥0.3g/24h或随机尿蛋白(+),可伴有上腹不适或头痛等症状；②重度,BP≥160/110mmHg,尿蛋白≥2.0g/24h或随机尿蛋白(++),血清肌酐>106μmol/L,血小板<100×109/L,血LHD升高,血清ALT或AST升高,持续性头痛或其他脑神经或视觉障碍,持续性上腹部不适。(3)子痫(eclampsia),子痫前期孕妇抽搐不能用其他原因解释。(4)慢性高血压并发子痫前期(preeclampsia superimposed upon chronic hypertension),高血压孕妇妊娠20周以前无蛋白尿,妊娠20周后突然尿蛋白增加(≥0.3g/24)或血压进一步升高或血小板<100×109/L。(5)妊娠合并慢性高血压(chronic hypertension complicating pregnancy),妊娠前或妊娠20周前舒张压≥90mmHg(除外妊娠滋养细胞疾病),妊娠期无明显加重；或妊娠20周后首次诊断高血压并持续到产后12周。近半个世纪以来,国内外学者对妊娠期高血压疾病的病因及发病机理、治疗及预防进行了大量的研究工作。我国妇产科界始终瞄准着国际科技前沿,对该病的病因学及发病机理进行了深入的研究,并取得可喜的进展。上述大量的研究,为妊娠期高血压疾病的发病机制,有效防治及改善母婴预后,奠定了理论基础。目前比较受认可的有关于妊娠期高血压疾病的病因有：异常滋养层细胞侵入子宫肌层、免疫机制、血管内皮细胞受损、遗传因素、营养缺乏、胰岛素抵抗等等。目的妊娠期高血压疾病的具体发病机制,目前尚不明确。子痫前期作为妊娠期高血压疾病的一个分类,发病机制同样不明确。因此尚无一种特效药物能根治该疾病。南方医院临床实践中发现,低分子肝素在辅助治疗子痫前期的患者时,具有较好的疗效。本实验利用荧光差异凝胶电泳(DIGE)这一蛋白质组学技术,分析低分子肝素治疗子痫前期(轻度)孕妇,其用药前、后蛋白质表达的变化。从而为明确低分子肝素辅助治疗子痫前期(轻度)患者,其作用机制,做出探索性的前期研究。方法有人说21世纪的生物科学是蛋白质科学占主导的世纪。蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病的发病机理和治疗有很大的相关性。因此蛋白质在发病机制中作用的研究日益受到关注。在生物学领域的概念里,蛋白质是功能事件的最终执行者,那么在低分子肝素辅助治疗子痫前期的机制中,究竟是那些蛋白发生了改变呢?差异蛋白质组学方法可以揭开这一层神秘的面纱。取五名子痫前期(轻度)患者的外周血样标本。该五名患者在年龄、体重、孕周等方面无明显差异。均为单病种病例,单胎妊娠。无高血压、糖尿病、肾病、胎膜早破等,无重大疾病家族史。且产后12周随访,均确定血压恢复正常。入院时即采集血样标本,作为低分子肝素治疗前的血样标本；皮下注射低分子肝素,6-8小时后,(根据药品说明书,血药浓度出现高峰后),再次收集上述五名患者的外周血。分别用试剂盒提纯血清蛋白后,把治疗前的血清蛋白标本混合,同样把治疗后的血清蛋白混合。经过除盐等程序后,利用DIGE的方法分析其差异蛋白表达。差异蛋白质组学能通过比较样本间蛋白质表达水平的变化,寻找差异分子,用以解决各种各样的生物学问题。差异蛋白质组学研究技术的不断革新使得从整体上研究蛋白质组在生理、病理过程中的变化成为可能。目前已涌现出许多新颖的差异蛋白质组分析方法,其中荧光差异凝胶电泳(difference gel electrophoresis,DIGE)技术由于继承了二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)的高分辨率,同时又具备高重现性、高灵敏度、高通量和高动态范围等优势,使得DIGE日益受到关注,成为最受欢迎的定量蛋白质组学研究手段之一。DIGE是一种在2-D电泳之前进行荧光染料标记蛋白样品的方法,通过对不同的蛋白样品用不同的荧光染料进行标记,在同一块双向凝胶中可同时分离多至三种不同的蛋白样品,并且每块胶上又引用了内标,内标的利用进一步增加可信度,确保结果能反映出真实的生物学差异,避免了系统误差实验结果的影响,从而能够对样品间蛋白质丰度差异进行精确分析。DIGE系统最大的优点就是整合了CyDye DIGE染料多重标记方法与DeCyder 2D差异分析软件的优势。DeCyder 2D差异分析软件利用了共找点检测的算法,能对荧光图像进行自动检测、背景消除、定量、归一化以及凝胶内匹配,避免了人为因素的影响,消除了不同操作者带来的系统误差。因为DIGE具有以上的优点,那么利用此技术平台将有很大机遇来揭示低分子肝素治疗子痫前期的机制。该技术具有初筛的作用,可缩小研究范围,寻找到起作用的蛋白质,为后续蛋白质的功能验证提供了理论基础。本实验首先建立了一套基于荧光差异双向电泳分离技术-基质辅助激光解析离子化-飞行时间/飞行时间质谱仪鉴定技术(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight/time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF)-生物信息学分析技术(bioinformatics)的差异蛋白质组学技术平台,并且对其灵敏度和重现性进行了考察。然后用DIGE技术建立了子痫前期患者使用低分子肝素肝素治疗前、后差异蛋白质组表达谱,通过DeCyder 2D差异分析软件分析后找到差异蛋白点11个,均为下调的点。选取其中下调明显的7个点,对这些差异蛋白点利用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行蛋白质鉴定,共鉴定出6种蛋白质。这些差异蛋白的同时出现,意味着它们之间有着直接或间接的联系,如何找到它们之间的联系,并且挖掘出这些联系在低分子肝素治疗子痫前期(轻度)机制的分子生物学意义,得出一个框架性的认识,为进一步深入的研究指明道路,这也是目前功能蛋白质组学十分关注和亟待解决的问题。而生物信息学(bioinformatics)可以作为解决这个问题的有用工具。我们分别对蛋白质进行功能分析,利用蛋白质数据库的蛋白质结构域(domain)和模体(motif)的分析,粗略地对鉴定的蛋白质进行功能分组,把这些差异蛋白功能主要归纳为参与细胞信号转导、物质转运、免疫调节等。然而仅仅以此,还不能达到了解蛋白质间相互关系的目的,还需要对蛋白质间的相互作用进行预测和分析。我们利用String蛋白相互作用数据库对这6种蛋白进行了一级相互作用(直接作用)的分析,结果发现这6种蛋白均有相互作用和联系。结果通过实验技术方法的探索,我们建立了一套基于DIGE分离-MALDI TOF/TOF质谱鉴定-生物信息学分析的差异蛋白质组学技术系统,并将其成功地应用于子痫前期患者使用低分子肝素治疗前、后的差异蛋白质组学分析。检测出差异蛋白点11个,对其中的7个差异较明显的点进行质谱鉴定,共鉴定出6种蛋白质。这不仅为揭示治疗过程的分子基础提供了新的技术方法,而且也从蛋白质组学的方面,为深入研究子痫前期的治疗策略提供了新的机遇。结论1.建立了DIGE技术平台,为实验室进行差异蛋白质组学研究提供了一种高可信度、高重复性的技术系统。2.建立了子痫前期(轻度)患者使用低分子肝素治疗前后的差异双向电泳图谱。3.用差异软件分析得到7个差异较明显的蛋白点,并进行质谱鉴定,结果鉴定出6种差异蛋白质。4.对6种差异蛋白质进行生物信息学分析,预测出这6个蛋白之间有直接相互作用的蛋白质-蛋白质复合物。