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肾性骨病(ROD)是慢性肾脏病的主要并发症之一,对患者的生存质量和生存时间有着重要影响。由于肾脏结构和功能的破坏导致肾脏羟化酶系的活性降低,1,25 (OH)2 VitD3的生成相对或绝对不足,PTH的合成与释放失控,是ROD发病的核心环节。Klotho基因(KL)是一种与衰老相关的基因,主要在肾小管、脑脉络膜和甲状旁腺表达,尤以肾皮质远曲小管表达最为强烈。KL基因缺陷鼠可出现一系列与人类“肾精亏虚证”相似的衰老表型变化。研究证实,KL在慢性肾脏病(CKD)肾组织中的表达明显下调,而KL下调可导致骨质疏松,说明KL可能参与发生ROD。另外,成纤维细胞生长因子23(FGF-23)、成骨蛋白-1(BMP-7)、骨保护素(OPG)作为调节骨和肠钙磷转运及骨代谢的激素,在ROD发生过程中起重要作用。那么,KL是否通过调控这些蛋白而参与发生ROD呢?如果能够证实这一假说,将进一步阐明ROD的发病机制并为临床治疗提供新靶点。本研究采用大鼠5/6肾切除残余肾模型,探讨KL基因对FGF-23、BMP-7、OPG的调控机制及肾安颗粒(复方淫羊藿苷、黄芪甲苷、大黄葸醌提取物)的干预作用,预期结果不仅能深化对ROD发病机制的认识,还将在一定程度上揭示中药防治ROD的作用机理。实验一大鼠残余肾模型的制备目的：探讨大鼠残余肾并肾性骨病模型的制备方法。方法：Wistar大鼠48只随机分为正常对照组(A组,n=8)、假手术组(B组,n=8)、造模组(C组,n=32)。经适应性喂养1周后,C组大鼠以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,行2/3左肾切除,1周后再次行右肾切除。各组大鼠均予正常饮食,A组和B组饮蒸馏水,C组左肾切除术后第二天开始加磷酸二氢钠饮水。各组大鼠造模术后1月眼球取血,测定血红蛋白(HGB)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血磷(P3+)、血钙(Ca2+)、血清碱性磷酸酶(ALP)、血清全段甲状旁腺激素(iPTH)。取血前1天代谢笼收集24h尿,测尿肌酐(UCr)并计算内生肌酐清除率(Ccr)。结果：造模术后1月,A、B两组大鼠活泼好动,毛色整齐光亮,体重增加；C组精神萎靡,安静不喜动,毛色杂乱,体重变化不明显。C组HGB与A组和B组比较明显降低(P<0.05)；C组BUN、Scr与A组和B组比较明显升高(P<0.01),C组Ccr与A组和B组比较明显降低(P<0.01)；C组ALP与A组和B组比较明显升高(P<0.05)；C组iPTH与A组和B组比较显著升高(P<0.01)；C组Ca2+与A组和B组比较明显降低(P<0.05)；C组P3+与A组和B组比较明显升高(P<0.01)。A、B两组间以上指标比较无显著性差异(P>0.05)。结论：5/6肾切除加高磷饮水1月可以导致残余肾模型大鼠钙磷代谢异常,继发PTH升高,提示并发ROD。实验二残余肾模型钙、磷代谢的变化及肾安颗粒的干预作用目的：探讨残余肾模型大鼠钙、磷代谢的变化及肾安颗粒的干预作用。方法：将第一部分实验中的造模组大鼠32只随机分为4组,即模型组(C组,n=8)、阳性药物骨化三醇对照组(D组,n=8)、肾安颗粒中剂量组(E组,n=8)、肾安颗粒高剂量组(F组,n=8)。正常对照组(A组,n=8)、假手术组(B组,n=8)与第一部分相同。D组以骨化三醇溶液灌胃；E、F组分别以中、高浓度肾安颗粒灌胃；A、B、C组以等量生理盐水灌胃。灌胃容量1ml/100g/日,总疗程8周。用药前后检测各组大鼠血HGB、Scr、BUN、P3+、Ca2+、ALP、iPTH,取血前1天代谢笼收集24h尿,测Ucr并计算Ccr。结果：各组大鼠存活情况：用药期间C组和D组各死亡1只,余各组大鼠均存活。用药前,C、D、E、F四组BUN、Scr、P3+与A、B两组比较明显升高,Ccr、Ca2+与A、B两组比较明显降低(P<0.05),ALP与A、B两组比较无明显变化(P>0.05)。用药8周后,A、B两组HGB、BUN、Scr、Ccr、P3+、Ca2+、ALP、iPTH与用药前比较无明显变化(P>0.05)；C组BUN、Scr、P3+、ALP、iPTH与用药前比较明显升高(P<0.05),Ca2+、Ccr、HGB与用药前比较明显降低；D组Ca2+与用药前比较明显升高(P<0.05),P3+较用药前略下降但无统计学意义(P>0..05),D组ALP与用药前比较降低(P<0.05),iPTH与用药前比较明显降低(P<0.01)；E组Ca 2+与用药前比较明显升高(P<0.05),P3+、ALP与用药前比较明显降低(P<0.05),iPTH与用药前比较显著下降(P<0.01)；F组Ca2+与用药前比较升高明显(P<0.05),P3+、ALP与用药前比较明显降低(P<0.05),iPTH与用药前比较显著降低(P<0.01)。用药后,D组Ca2+与C组比较明显升高(P<0.05),ALP、iPTH与C组比较均明显降低(P<0.05),P3+与C组比较无显著性差异(P>0.05)；E组Ca2+与C组比较明显升高(P<0.05),P3+、ALP、iPTH与C组比较均明显降低(P<0.05或P<0.01)；F组Ca2+与C组比较明显升高(P<0.05),P3+、ALP、iPTH与C组比较均显著降低(P<0.05或P<0.01)。用药8周后,E、F两组HGB、CCr与D组比较明显升高(P<0.05),Scr与D组比较明显降低(P<0.05),BUN与D组比较无显著性差异(P>0.05)。E、F两组Ca2+、ALP、iPTH与D组比较均无显著性差异(P>0.05),P3+与D组比较明显下降(P<0.05)；E、F两组间上述各指标比较无显著性差异(P>0.05)。结论：肾安颗粒具有稳定残余肾模型大鼠肾功能、提高HGB、改善钙磷代谢、抑制甲状旁腺机能亢进的作用。实验三KLOTHO基因在残余肾模型大鼠的表达及肾安颗粒的干预作用目的：探讨KL基因在残余肾模型大鼠的表达及肾安颗粒的干预作用。方法：分组方法及用药同第二部分。用药结束后,处死全部大鼠,取肾脏和股骨,肾组织常规包埋切片染色行光学显微镜检查,以双能X射线骨密度仪测定股骨头部的骨密度。采用Real-timePCR检测大鼠肾脏KLothomRNA的表达；采用Western blot检测肾脏KLotho蛋白、股骨FGF-23、BMP-7、OPG蛋白水平；免疫组化法检测股骨BMP-7、OPG表达；免疫荧光检测股骨FGF-23表达。结果：骨密度：C组与A、B两组比较明显降低,E、F、D组与C组比较明显升高(P<0.05),E组与D组比较略有升高,但无统计学意义(P>0.05),F组与D组比较无显著性差异(P>0.05)。KLothomRNA:C组和D组的表达与A组和B组比较明显减低(P<0.01或P<0.05)；E、F组表达与C组比较明显增强(P<0.01)；E、F组两组表达与D组比较明显增强(P<0.05)。Klotho蛋白：A组的表达均高于其它各组,与C组相比明显增高(P<0.01)；E、F组的表达与C组和D组比较明显增高(P<0.05)；E组与F组间比较无差异性(P>0.05)。Western blot及免疫荧光检测FGF-23：C、D、F三组表达均明显高于A组和B组(P<0.05或P<0.01),E组表达与A组和B组比较无明显差异(P>0.05)；D、E、F三组表达明显低于C组(P<0.05)；E组表达低于D组和F组(P<0.05)。Western blot及免疫组化检测BMP-7：在大鼠股骨中,C、D、F三组表达明显低于A组和B组(P<0.05或P<0.01),E组表达略低于A组和B组但无统计学意义(P>0.05)；D、E、F三组表达与C组比较明显升高(P<0.05)；E、F两组表达高于D组(P<0.05)。Western blot及免疫组化检测OPG:C组表达明显低于A组和B组(P<0.05)；D、E、F三组表达明显高于C组(P<0.05)；D、E、F三组间比较无显著性差异(P>0.05)。KL表达与FGF-23、BMP-7、OPG表达的关系：在模型组,随着KLotho表达的下调,FGF-23表达升高,BMP-7、OPG表达降低；肾安干预后,随着KLotho表达的上调,FGF-23表达下降,BMP-7、OPG表达升高。结论：KL基因在残余肾模型肾组织中的表达降低,与FGF-23呈明显负相关,与BMP-7、OPG呈明显正相关,肾安颗粒可能通过上调KL基因的表达,下调FGF-23,刺激成骨细胞BMP-7及OPG的合成,调节肾、骨、肠对钙、磷的转运,从而改善ROD。