一般认为,幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）导致胃癌的发病机理是由其触发的炎症引起的胃萎缩、肠上皮化生、异型增生并最终发展成腺癌的一个多级发展过程。H.pylori感染引起胃炎和胃萎缩,是促成癌前病变和最终导致胃癌的重要因素。机体对于H.pylori感染能够产生免疫应答,但是并不能完全有效地清除H.pylori。H.pylori对宿主的毒性作用、免疫逃逸作用以及宿主对H.pylori的杀灭清除作用存在着有机的动态平衡,但这种平衡的分子机制尚不明确。非编码RNA,即不能编码蛋白质的RNA,包括核糖体RNA（r RNA）,转运RNA（t RNA）,小干扰RNA（siRNA）,核内小RNA（snRNA）,核仁小RNA（small nuclear RNA,sno RNA）,微小RNA（microRNA）,piwi相互作用RNA（piwi-interacting RNAs,piRNA）及长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）等多种RNA,其中大部分RNA的功能是已知的,但也有相当一部分的RNA类型,具有特殊的结构,其功能也没有得到广泛的研究。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来,但是不翻译成蛋白,在RNA水平上就能行使各自的生物学功能了。从不同层面调控基因表达的非编码RNA,根据分子长度划分为microRNA及lncRNA。目前约有8000多种microRNA得到鉴定,其中1500多种microRNA在哺乳动物体内表达。在人类基因组中已经明确标定的lncRNA有9640种。microRNA是一类带有18-24个核苷酸的RNA,影响多种基因的转录和表达,在炎症、细胞增殖、细胞凋亡和变异中起着重要作用。lncRNA在近年的研究中得到了极大的关注,越来越多的学者和实验室致力于研究其结构和功能。大多数的lncRNA参与的生物学功能包括基因印记、染色体修饰、蛋白质结合与干扰等,也有部分lncRNA行使其功能与microRNA相类似,通过激活或干扰转录本,实现对某个特定蛋白的靶向激活或抑制。同时,还有大量的lncRNA尚未知其功能。本研究通过H.pylori感染人胃上皮细胞模型,利用全基因组测序技术检测H.pylori感染前后胃上皮细胞的lncRNA表达谱变化,结合实时定量PCR,对差异lncRNA进行筛选与鉴定。选取差异表达最明显的XLOC₀04122和XLOC₀14388,检测其在临床H.pylori感染组织样本的表达特性,并探讨其与致肿瘤预后指标是否存在相关性。同时,针对同样差异表达的microRNA-146a和microRNA-99b,通过靶点鉴定和功能分析等手段,深入研究其调控H.pylori感染的分子机制。本研究分为三部分:（一）幽门螺杆菌侵袭胃上皮细胞引起的长链非编码RNA差异表达分析;（二）microRNA-146a靶向COX-2调控H.pylori引起胃癌细胞凋亡的研究;（三）microRNA-99b在胃癌上皮细胞中通过调控自噬发生抑制H.pylori感染及细胞增殖作用研究。第一部分 幽门螺杆菌侵袭胃上皮细胞引起的长链非编码RNA差异表达分析本实验利用H.pylor感染人胃上皮GES-1细胞24小时后,提取细胞的total RNA,利用全基因组测序手段,筛选鉴定差异表达的lncRNA分子;收集临床病人胃上皮组织样本,应用Realtime RT-PCR技术检测lncRNA分子在H.pylor感染病人和非感染病人中的表达规律,探讨lncRNA分子在H.pylor致癌发生、发展的关系及其在临床预后判断中的应用意义。同时,利用GO分析及基因共表达分析等生物信息学分析手段,探索差异表达的lncRNA的生物学功能。结果显示,H.pylori感染引起GES-1细胞一系列非编码RNA的表达改变,其中表达上调的有24条lncRNA,表达下调的有22条lncRNA。其中五条lncRNA,XLOC₀04562（p<0.05）,XLOC₀05912,XLOC₀00620,XLOC₀04122（p<0.05）和XLOC₀14388（p<0.05）的表达差异最显著,并已被PCR结果证实。同时发现,XLOC₀04122和XLOC₀14388在临床H.pylori感染的组织样本中显著差异表达,差异具有统计学意义,且与肠化生现象成线性相关性（p<0.05）。这提示这两段基因在临床治疗及预后方面可能存在标志物的功能。GO分析和共表达分析发现,XLOC₀04122共表达主要包括膜蛋白组份、跨膜蛋白、离子通道等相应功能的基因,这说明XLOC₀04122可能参与H.pylori被细胞胞吞的过程;XLOC₀14388共表达的主要包括细胞间的信号传递、激酶活性、神经发育等功能的基因。本研究的意义在于我们可能发现了治疗H.pylori感染及预防其癌变的新方法,有广阔的临床应用前景。第二部分 microRNA-146a靶向COX-2调控H.pylori引起胃癌细胞凋亡的研究本实验通过向H.pylori感染的胃癌细胞MKN7转染microRNA-146a mimics和inhibitor,建立microRNA-146a过表达及抑制表达的细胞模型,利用V-Fluos staining kit（凋亡检测试剂盒）测定细胞凋亡率,结合凋亡正相关标志物Bax和负相关标志物Bcl-2的表达,确定microRNA-146a是否可以影响癌细胞的发生并深入探讨microRNA-146a对癌细胞的凋亡发生影响是否通过抑制靶基因COX-2实现。同时,检测胃癌临床样本中,microRNA-146a表达与凋亡发生率的相关性并分析microRNA-146a与肿瘤预后的相关性。结果显示:H.pylori感染的癌细胞模型和临床样本中,microRNA-146a表达（p<0.05）和细胞凋亡发生率（p<0.05）均显著高于H.pylori阴性对照组;microRNA-146a过表达的肿瘤细胞较对照组凋亡率显著升高（p<0.05）,且凋亡正相关分子Bax显著上调（p<0.05）,负相关分子Bcl-2显著下调（p<0.05）;在此细胞模型中,对COX-2的过表达可抑制microRNA-146a对凋亡的上调作用（p<0.05）,说明microRNA-146a对细胞凋亡的调控是通过靶向抑制COX-2的表达实现的。进一步的临床样本分析发现,microRNA-146a与肿瘤组织细胞凋亡率正相关,且与肿瘤的淋巴转移具有显著相关性（p<0.05）。本实验结果说明microRNA-146a可能通过调控COX-2表达,促进凋亡,进而抑制H.pylori感染引起的胃癌发生。这部分研究的发现进一步阐明H.pylori感染的致癌发生机制以及机体对H.pylori的致癌作用调节机制研究提供新的方向。第三部分 microRNA-99b在胃癌上皮细胞中通过调控自噬发生抑制H.pylori感染及细胞增殖作用研究本实验在H.pylori感染的胃癌细胞模型和临床样本中,检测microRNA-99b的表达。通过向H.pylori感染的胃癌细胞转染microRNA-99b mimics和inhibitor,建立microRNA-99b过表达及抑制表达的细胞模型,检测细胞内H.pylori菌荷菌量的变化;利用Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II,转染GFP-LC3并利用激光共聚焦技术对LC3进行斑点计数,从而判定microRNA-99b是否可以调控自噬发生;同时,利用生物信息学软件预测microRNA-99b的靶基因,并通过靶基因荧光素酶报告基因实验,鉴定microRNA-99b的靶基因并分析microRNA-99b调控自噬的分子机制是否通过抑制靶基因实现的。结果显示,H.pylori感染的胃癌细胞模型和临床样本中,microRNA-99b表达（p<0.05）显著高于H.pylori阴性对照组;microRNA-99b过表达的肿瘤细胞对H.pylori的杀菌作用强于对照组,结果具有统计学意义（p<0.05）;Western blot结果显示,LC3分子由LC3-I向LC3-II转化,说明microRNA-99b过表达可诱导细胞自噬的发生,对LC3斑点计数也印证了这一点（p<0.05）;利用targetscan软件预测到microRNA-99b的靶基因为m TOR。荧光素酶报告基因实验证实了microRNA-99b确实能与m TOR的3′-UTR结合;Western blot结果表明,microRNA-99b通过抑制m TOR蛋白表达促进自噬的发生。结论:综合本文的发现及相关数据,我们提出以下结论:1.筛选鉴定出H.pylori感染引起的差异表达的长链非编码RNA,并发现XLOC₀04122和XLOC₀14388在临床H.pylori感染的组织样本中显著差异表达,且与肠化生现象成线性相关性。提示这两段基因在临床治疗及预后方面可能存在标志物的功能。2.发现microRNA-146a在H.pylori感染中调控细胞的凋亡和癌变,并证实是通过靶向COX-2实现此功能。microRNA-146a也与胃癌的淋巴转移正相关。3.发现microRNA-99b在H.pylori感染中刺激细胞自噬发生并因此上调细胞杀菌能力。此功能是通过靶向抑制m TOR蛋白的功能实现的。