猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)可导致仔猪的严重腹泻,尤其在东亚各国传播非常广泛,每年都造成严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属,是Ⅰ群冠状病毒的成员。目前对于PEDV感染机理方面的研究较少,2007年猪氨基肽酶(porcine aminopeptidase N, pAPN)被证实为PEDV的功能性细胞感染受体,继而又有研究从数量上证实增加pAPN的密度增大可以PEDV感染率。2010年新的研究通过尝试多种不同方式将pAPN添加到Vero细胞后再感染PEDV,进一步可证明pAPN对PEDV的入侵和增殖的促进作用。至今,还未见其它有关PEDV感染机理以及pAPN在PEDV感染过程中作用的研究报道。为进一步确定pAPN与PEDV结合的区域,首先将除去信号肽的pAPN分为SPA, SPB和SPC三段,接着利用一对同尾酶Xholl和SaiⅠ将信号肽分别与SPA,SPB和SPC相连接后再构建到杆状病毒表达载体pFastBacTM1上,通过杆状病毒-昆虫细胞表达体系进行表达。分得到的三段蛋白经SDS-PAGE与Western-blot鉴定大小分别为SPA约42kD,SPB和SPC均约56kD,与预期值相符。再利用得到的蛋白免疫小鼠制备相应的抗血清,各段抗血清均可与天然pAPN反应,证明了所制蛋白具有一定特异性。为了使pAPN分段蛋白在真核细胞上进行表达,将与信号肽相连的SPA,SPB和SPC片段构建到哺乳动物真核细胞表达载体pcDNA3.1上,分别将三个片段转染到PEDV非容许性细胞MDCK上,应用免疫荧光检验其在MDCK细胞上的表达情况,结果表明SPA,SPB和SPC片段与天然pAPN的多抗血清反应均出现了明亮的绿色荧光,证明了三个片段转染到MDCK后均得到表达。分别将表达三个片段的MDCK细胞接种PEDV48h后观察到细胞的病变情况,结果在SPC段的MDCK上接种PEDV48h后出现了明显的细胞脱落,变形等病变。同样,应用免疫荧光技术也可以在转染SPC片段的MDCK细胞上检测出明亮而清晰的绿色荧光,进一步说明了表达的SPC可以与PEDV相结合。将PEDV在表达SPC的MDCK上连续传代五代后通过PCR的方法仍可以检测到PEDV的存在,这也证明了在MDCK上表达SPC段蛋白可使PEDV在非容许的细胞上进行增殖。最后在表达SPC的MDCK上添加相应片段抗血清,病变可被抑制发生。以上结果均说明SPC段在PEDV入侵细胞及增殖过程中发挥着重要的作用,即受体功能域的所在是pAPN第500a.a.-963a.a.。从而达到对受体功能域的初步筛选,并为研究PEDV在非容许性细胞MDCK上的增殖奠定了基础。