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目的:革兰阴性菌内毒素—脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是其细胞壁结构组分,当细菌死亡裂解时游离出来发挥毒性作用。CD36作为一种模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)可介导细胞识别LPS等多种抗原,由于其特殊的跨膜结构,还具有介导信号通路和调节细胞功能等作用;CD36的泛素化能快速调节其在细胞膜上的含量并影响其自身功能,因此藉用CD36泛素化位点的突变可考察泛素化对其功能的影响。巨噬细胞(macrophage)是机体重要的免疫细胞,也是炎症反应的主要参与者。LPS能有效地诱导巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6等炎症因子,亦可诱导细胞自噬等反应参与抗感染免疫。CD36作为一种重要的PRR,在巨噬细胞中亦有丰富的表达,而对其在LPS诱导的巨噬细胞自噬和炎症因子分泌中的影响及分子机制研究甚少;CD36泛素化对其介导的信号通路和细胞功能有何影响尚待研究。野生型中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)无CD36的天然表达,同时该细胞还具有高扩增和表达特点,因此本课题第一部分以LPS与稳定转染空质粒、野生型cd36基因和泛素化位点突变cd36基因的CHO细胞(CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A)共作用,探讨CD36及其泛素化对LPS诱导的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路和自噬的影响。第二部分首先利用si RNA和ERK抑制剂干预手段处理鼠源巨噬细胞RAW264.7,通过建立LPS与不同条件预处理的巨噬细胞RAW264.7共作用为细胞模型,研究巨噬细胞中CD36对LPS诱导的自噬和炎症因子分泌的影响及分子机制,为阐明CD36对LPS诱导的自噬和炎症因子分泌的影响及分子机制提供理论和实验依据。方法:一、CD36及其泛素化对MAPK信号通路及自噬的影响1.LPS与CHO细胞共作用适宜浓度和时间的确定本实验分别以0、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng/ml LPS与CHO/CD36WT细胞共作用相同时间后收集细胞;进而将100 ng/ml LPS与CHO/CD36 WT细胞分别共作用0、10、30、60、120、240 min后收集细胞。采用蛋白质印迹技术(western blot,WB)检测上述所收集细胞中ERK磷酸化水平,以确定LPS与CHO细胞共作用适宜的浓度和时间。2.CD36及其泛素化对MAPK信号通路的影响MAPK信号通路参与细胞中多种生理病理过程并发挥着重要作用。在MAPK家族中细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38是研究最广泛和最重要的蛋白激酶,其磷酸化水平高低决定了其活性程度。实验分别设置LPS与CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A细胞共作用的组份及相应的未加LPS作用的阴性对照组,共6组。根据上述实验确定的LPS工作条件,以100 ng/ml LPS作用细胞2 h后,WB检测ERK、JNK和p38磷酸化水平,即ERK、JNK和p38的活性。3.CD36及其泛素化对LPS诱导自噬的影响蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)在自噬过程中的作用具有保守性,且甘油二酯(diacylglycerol,DAG)与其亚基上的C1位点结合直接影响其功能发挥;GFP-PKC-C1质粒表达的蛋白以弥散形式存在细胞中,与DAG结合后会以点状聚集物的形式存在,因此结合了DAG的GFP-PKC-C1表达蛋白形成的绿色点状聚集物可显示细胞中DAG的情况。将带有红色荧光的RFP-LC3质粒和带有绿色荧光的GFP-PKC-C1质粒共同导入CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A细胞中,并设置LPS作用组和LPS未作用的阴性对照组,LPS与细胞共作用2 h后,用共聚焦激光扫描显微镜(confocol laser scanning microscope,CLSM)观察各组细胞中自噬体和DAG的共定位情况。二、巨噬细胞CD36对LPS诱导的自噬和炎症因子的影响及分子机制研究1.LPS与RAW264.7细胞共作用浓度和时间的确定以含有0、5、10、20、50、100、500、1000 ng/ml LPS的培养液作用RAW264.7细胞相同时间后收集细胞;再分别收集100 ng/ml LPS与RAW264.7细胞共作用0、0.5、1、2、4、8、16、24 h的细胞,WB检测自噬标志蛋白:微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,MAP1-LC3-Ⅱ)的表达,以确定LPS与RAW264.7细胞共作用时适宜的浓度和时间。2.LPS对RAW264.7细胞中MAPK活性及自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达的影响分别设置LPS与RAW264.7细胞共作用组和LPS未作用的阴性对照组。用上述方法确定的LPS工作条件,将100 ng/ml LPS与细胞共作用16 h后收集细胞,WB检测ERK、JNK和p38磷酸化水平,自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达。3.巨噬细胞CD36对LPS诱导的ERK活性、自噬及炎症因子的影响利用si RNA干扰巨噬细胞中CD36的表达,再用LPS作用正常细胞和si RNA干扰的细胞,同时设置未被LPS作用的正常细胞和si RNA干扰的细胞组份,共4组。LPS作用16 h后收获细胞:①WB检测ERK磷酸化水平、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达;②免疫荧光法检测细胞中自噬体即LC3点状聚集物的含量变化。同时,收集LPS作用16 h后的培养基上清液,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测其中的细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)。4.ERK抑制剂对LPS诱导的自噬及炎症因子的影响首先用0、5、10、20、50、100 n M ERK抑制剂(PD 0325901)作用细胞24 h后,WB检测ERK磷酸化水平,并用噻唑蓝还原法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)测定细胞存活率,以确定ERK抑制剂的工作浓度。为进一步探讨ERK活性对自噬及炎症因子的影响,建立ERK抑制剂干预细胞模型,即阴性对照组、ERK抑制剂干预组、LPS作用组和LPS作用ERK抑制剂干预组,LPS作用16 h后收集细胞和培养基上清液,检测指标和方法同3。结果:一、CD36及其泛素化对MAPK信号通路及自噬的影响1.LPS与CHO细胞共作用适宜浓度和时间的确定:WB结果显示,在不同浓度LPS作用CHO/CD36 WT细胞后,100 ng/ml LPS作用下的ERK磷酸化水平达到最高。与其他时间点相比,100 ng/ml LPS作用细胞2 h后ERK磷酸化水平达到最高。综上所述,将100 ng/ml LPS作用CHO细胞2 h作为后续实验条件。2.CD36及其泛素化对MAPK信号通路的影响:以上述实验条件,LPS分别作用CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A三株细胞。WB结果显示,LPS作用CHO/CD36 WT细胞后,p ERK/t ERK值和p JNK/t JNK值显著升高,即ERK和JNK活性显著增高,p38的活性无明显变化;而LPS与CHO/Vector细胞和CHO/CD36 K/A细胞共作用后,ERK、JNK和p38活性均无明显变化。3.CD36及其泛素化对LPS诱导的自噬的影响:RFP-LC3和GFP-PKC-C1质粒共同转染至CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A细胞后,CLSM结果显示,LPS分别与CHO/CD36 WT细胞和CHO/CD36 K/A细胞共作用后,细胞中红色点状聚集物和黄色点状聚集物数量明显高于未加LPS作用的阴性对照组;也显著高于LPS作用的CHO/Vector细胞;而LPS作用的CHO/CD36 WT细胞与LPS作用的CHO/CD36 K/A细胞相比,细胞中的红色和黄色点状聚集物数量未见显著差异。二、巨噬细胞CD36对LPS诱导的自噬和炎症因子的影响及分子机制研究1.LPS与RAW264.7细胞共作用浓度和时间的确定:WB结果显示,100 ng/ml LPS作用细胞后,LC3-Ⅱ表达水平升高并已达到峰值。以100 ng/ml LPS作用细胞不同时间,随作用时间的延长,细胞中LC3-Ⅱ表达水平逐渐升高,在16 h时LC3-Ⅱ表达水平达到峰值。结合参考文献和实验结果,将100 ng/ml LPS作用RAW264.7细胞16 h作为后续实验条件。2.LPS对RAW264.7细胞中MAPK活性及LC3-Ⅱ和Beclin-1表达的影响:以上述实验条件,将100 ng/ml LPS作用RAW264.7细胞16 h,收集细胞。WB结果显示,与LPS未作用的阴性对照组相比,p ERK/t ERK值和p JNK/t JNK值在LPS作用后升高,即ERK和JNK活性增高;而p38的活性无明显变化;LC3-Ⅱ/Tubulin值和Beclin-1/Tubulin值显著升高。3.巨噬细胞CD36对LPS诱导的ERK活性、自噬及炎症因子的影响:WB检测CD36、ERK磷酸化水平及自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达。结果发现,CD36表达水平高的正常巨噬细胞在LPS作用后,ERK活性显著升高,LC3-Ⅱ/Tubulin值及Beclin-1/Tubulin值升高;LPS作用CD36 si RNA预处理的细胞,CD36表达显著下降,ERK活性降低,LC3-Ⅱ/Tubulin值及Beclin-1/Tubulin值却进一步升高。CLSM结果显示,LPS作用的巨噬细胞中绿色点状聚集物数量高于阴性对照组;当下调CD36表达时,LPS诱导细胞中绿色点状聚集物数量仍进一步升高。ELISA结果显示,LPS作用下细胞分泌TNF-α和IL-6水平显著升高,而IL-10分泌水平无显著差异;CD36表达下降导致细胞TNF-α和IL-6分泌水平下降,而IL-10分泌水平明显升高。4.ERK抑制剂对LPS诱导的自噬及炎症因子的影响:MTT结果显示,在不高于20 n M浓度的ERK抑制剂作用下,细胞存活率均超过50%。WB结果发现,在20 n M和50 n M ERK抑制剂作用下,细胞中ERK活性最小,抑制效果最好。综上所述,将20 n M作为ERK抑制剂的工作浓度干预细胞。WB结果显示,LPS作用下细胞中ERK活性明显升高,LC3-Ⅱ/GAPDH值及Beclin-1/GAPDH值升高;进而用20 n M ERK抑制剂干预细胞发现,ERK活性明显下降,而LPS作用后LC3-Ⅱ/GAPDH值进一步升高。CLSM结果显示,LPS作用下细胞中的绿色点状聚集物数量高于阴性对照组;ERK抑制剂干预细胞ERK活性后,LPS诱导细胞中绿色点状聚集物数量进一步升高。ELISA检测结果显示,ERK抑制剂的干预能使LPS诱导的TNF-α分泌水平显著下降,IL-6的分泌水平下降,而IL-10分泌水平升高。结论:1.LPS与CHO细胞共作用后发现,CD36介导细胞中ERK和JNK的活化,且在介导LPS诱导的自噬过程中是必不可少的;CD36泛素化位点突变后,LPS所致的ERK和JNK的活化与阴性对照相比未见明显差异;CLSM结果显示,泛素化位点的突变未见对CD36介导DAG相关自噬体形成的明显变化,但对CD36泛素化是否影响自噬的确切机制还有待进一步研究。2.在巨噬细胞中,ERK信号通路参与了LPS诱导的自噬和炎症因子释放过程。CD36通过ERK信号通路负向调节LPS诱导的自噬和抑炎因子的释放,正向调节促炎因子的释放。