百草枯(paraquat,PQ),又称克无踪、对草快,属于有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂。化学名称是1,1’-二甲基-4,4-’联毗啶,分子式为C12 H14 N2·2Cl。自1962年起,百草枯作为除草剂应用于农业并得到迅速推广,目前在中国农村应用非常广泛。但人和动物摄入百草枯后,会表现出强烈的毒性。我国常可见到百草枯中毒病例,即使食入少量百草枯,也表现出极高死亡率,个别报道高达80％以上。　　 百草枯可引起多脏器损伤,但以肺损伤最为突出。肺损伤表现为肺水肿、炎症细胞浸润、肺泡出血、成纤维细胞增生和胶原沉积。百草枯中毒患者临床表现分为两个阶段:早期患者在中毒数天内死于急性呼吸窘迫综合征和多脏器功能衰竭。大多数早期存活下来的患者将逐渐出现不可逆的肺间质纤维化并在数周内死亡。个别幸存的病人由于存在肺间质纤维化,也严重影响其生存质量。　　 转化生子因子-β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)可以诱导胶原合成和基质改变,在各种类型的肺间质纤维化中都具有重要的作用,被称为纤维化进程的“开关因子”。在百草枯中毒的早期,就可检测到TGF-β1mRNA和蛋白表达增强。近几年的研究表明,TGF-β1信号是通过Ⅰ、Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体进行传导。激活的Ⅰ受体磷酸化下游的信号分子,受体激活型的Smads蛋白(Smad2和Smad3),它们将与Smad4结合,转录入核,调节TGF-β应答基因的转录,进而引起纤维化相关的改变。其中,Smad3基因的表达在肺纤维化中起重要作用。敲除Smad3的小鼠对博来霉素诱导的肺间质纤维化表现出极大的抵抗,提示抑制肺组织中Smad3基因表达对药物性肺纤维化有治疗作用。　　 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种新的技术手段,能在体内或体外特异性的抑制靶基因的表达。RNAi主要通过在转录后水平阻断基因的表达,因此又称为转录后基因沉默。其作用主要是通过dsRNA被核酸酶切割成21-25nt的干涉性的小的RNA即siRNA,由siRNA识别介导并靶向切割同源性的靶mRNA分子实现的。RNAi具有高效性和高度特异性等特点。目前发展的载体表达短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),既避免了引起干扰素应答,又允许组织特异性的抑制基因表达,使RNAi更方便进行哺乳动物水平的实验研究和基因水平的治疗。腺病毒作为基因载体能感染绝大部分细胞,是体外进行基因沉默的有效载体,对肺组织中的上皮细胞和间质细胞具有很好的转染率。　　 目的：　　 本实验在百草枯致小鼠肺间质纤维化模型基础上,利用免疫组化的方法,分析从早期炎症反应阶段和纤维化进展期中TGF-β1和Smad3在肺组织中的表达和定位。并进一步通过重组腺病毒携带shRNA,沉默百草枯染毒小鼠肺组织中的Smad3基因,观察其对肺间质纤维化形成的保护作用。　　 材料和方法：　　 1、免疫组化研究TGF-β1和Smad3在百草枯致肺间质纤维化早期过程中的表达和定位　　 (1)百草枯致小鼠肺间质纤维化模型的建立　　 雄性C57BL/6J小鼠,8-10w,18-22g,在相同条件下饲养,恒温恒湿,人工照明12h/d,24h自由进食水。百草枯溶液从小鼠腹腔(10mg/kg)注入。对照组腹腔注入等量生理盐水。　　 (2)标本的采集和免疫组化研究　　 在实验组不同时间点(2、5、7、14d)和对照组(7d)对小鼠进行处理。左肺叶用4％多聚甲醛固定,用于HE染色。免疫组织化学方法分析不同时间点TGF-β1和Smad3在肺组织中的表达和定位。　　 2、沉默小鼠Smaqd3基因的shRNA筛选和重组腺病毒的构建　　 (1)shRNA的制备和载体的构建　　 根据小鼠Smad3mRNA(GenBank Accession No NM_016769),编码短发夹转录序列。委托武汉晶赛生物技术公司编码短发夹RNAs合成进质粒pGenesi11.1+GFP。通过细菌克隆对质粒进行扩增,阳性的克隆被进一步通过测序鉴定。　　 (2)细胞培养和转染　　 质粒转染用小鼠L929成纤维细胞。分组为空白对照、负对照、转染pGenesi11.1+GFP Smad3-1、pGenesi11.1+GFP Smad3-2、pGenesi11.1+GFP Smad3-3质粒组。细胞在转染后48和72h进行收集。收集后的细胞用流式细胞仪对阳性克隆进行分选。对细胞进行RNA提取和实时荧光PCR分析,并进行Western Blot检测,筛选高效抑制Smad3表达的shRNA。并将筛选出的shRNA合成进重组腺病毒。　　 3、重组腺病毒感染动物实验　　 (1)动物实验的分组和重组腺病毒的感染:　　 在百草枯致小鼠肺问质纤维化模型的基础上,分组如下:小鼠染毒后2h气管内注入药品(PBS组,50μlPBS缓冲液;非靶向重组腺病毒组,50μl含1×109pfu携带非靶向shRNA重组腺病毒悬液;靶向重组腺病毒组,50μl含1×109pfu的携带shRNA重组腺病毒悬液)。每个时间点(0、2、7、14、28d)5只。　　 (2)标本收集及检测指标　　 不同时间点对实验小鼠进行处理。取左肺叶一块4％多聚甲醛固定,用于HE染色。另取左肺组织30mg用于羟脯氨酸(HYP)测定。取右肺组织0.5克,放入高压过的1.5毫升管中,放入低温冰箱中保存(Real time PCR检测Smad3、Ⅰ型前胶原、GAPDHmRNA表达)。在0、7d取一块右肺(同上大小)置于EP管中,冻于-70℃(Western检测细胞核中的Smad3蛋白)　　 4、统计学分析　　 所有数据采用SPSS16.0软件进行统计处理,计量资料以均数士标准差表示,两组件均数比较采用t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示有显著性差异。　　 结果：　　 免疫组化结果:对照组肺泡腔中的少量巨噬细胞可观察到TGF-β1染色阳性。染毒后2d-7d时TGF-β1染色阳性主要见于浸润的巨噬细胞和中性粒细胞的胞浆中。14d时TGF-β1染色阳性也见于成纤维细胞灶中的成纤维细胞和肌成纤维细胞。细胞外的。TGF-β1阳性信号主要见于肺间质和肺泡腔中。对照组Smad3阳性表达见于少量支气管上皮细胞和肺泡腔中的巨噬细胞。在第2-7d,Smad3阳性表达见于浸润中的巨噬细胞和一些Ⅱ型肺泡上皮细胞。Smad3阳性信号见于细胞核。第14d,除了可见细胞核Smad3阳性的巨噬细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞外,在成纤维细胞灶中,增生的成纤维细胞核中也可见到Smad3弱阳性表达　　 体外实验中共设计了和合成了3个Smad3的shRNA序列,并将其合成进pGenesi11.1+GFP质粒。3个Smad3 shRNA分别被转染进L929成纤维细胞。以空白对照组作为基础,通过Real TimePCR和Western检测不同shRNA抑制Smad3表达的效果。在转染后48和72h,转染组的Smad3的mRNA和蛋白表达显著被抑制,而在空白对照和负对照组并没有受到影响。在这些特异性的shRNA中,Smad3-shRNA3显示出最高的抑制效率。因此,我们选择这个shRNA表达质粒进行下一步的重组腺病毒感染动物的实验。　　 PBS组、非靶向腺病毒组和靶向腺病毒组在小鼠染毒后第2d均出现Smad3mRNA表达下降,并达到最低值,随后逐渐增加。靶向腺病毒与前两组相比,第2、7、14d时表达显著下降。小鼠在染毒后,出现了Smad3在肺组织细胞核中的聚集。在靶向腺病毒组中,细胞核中Smad3聚集情况显著减轻。　　 HE染色结果表明靶向腺病毒组与PBS组和非靶向腺病毒组相比,在7d、14d成纤维细胞增生、胶原沉积等纤维化程度较轻。28d肺纤维化程度显著轻于对照组,肺泡腔塌陷少见,成纤维细胞增生相对较少。　　 在PBS组和非靶向腺病毒组,染毒后7d时Ⅰ型前胶原mRNA表达相近。但在靶向腺病毒组,Ⅰ型前胶原mRNA表达却显著减少,约为PBS组的1/3(P＜0.01)。　　 在染毒后28d,羟脯氨酸的检测靶向腺病毒组是573μg/mg,和前两组相比显著减少,具有统计学意义(P＜0.05)。对肺组织Smad3基因的转录后沉默减少了百草枯所致的肺组织的羟脯氨酸含量的增加。　　 结论：　　 1、在百草枯致肺间质纤维化过程中,TGF-β1/Smad信号转导通路具有重要的作用。下调TGF-β1通过Smad3蛋白进行的信号传导对治疗本病具有重要意义。　　 2、通过RNA干扰抑制肺组织Smad3基因转录后表达可能是一种有效的治疗百草枯致肺间质纤维化的方法。