研究背景： 应用大肠杆菌生产重组蛋白，在从摇瓶到发酵罐的放大过程中，我们往往会遇到蛋白表达水平下降的问题。这种问题可以由多种因素造成，目前并没有万能的解决办法。培养基和培养条件优化则是较为传统的提高蛋白生产水平的方法，优化的因素有pH、温度、针对不同培养时期碳氮源的比例和浓度的优化、各种各样的分批培养方法、控制乙酸产生以及控制溶氧等。近二十年来，有关溶氧和乙酸代谢在放大过程中对重组蛋白的表达影响的研究很多，但仅仅站在这种研究角度很难解释一些现象。蛋白表达水平下降是不是由于比生长速率的原因，或者是高浓度乙酸的抑制，或者是菌体呼吸活性的原因，亦或是其他的生理状态造成的呢？ 论文概况： 本论文首次阐明了在应用大肠杆菌生产重组蛋白发酵放大过程中铵离子的重要作用，建立了简便易行的氨盐胁迫发酵放大技术，并初步研究了蛋白表达致菌体死亡的机制和铵离子提高重组蛋白表达的机理。氨胁迫培养相对于常规的分批培养来说，可以通过重组蛋白表达水平的提高成倍地增加重组蛋白表达总量，虽然菌体密度相对地要低一些。例如对于rtPA的表达，氨胁迫培养和对照培养的菌体最终OD600分别为27.5和30.2，但前者的表达水平为后的3倍，因此总的重组蛋白生产水平为大约后者的2.7倍。对于HIV-TAT-survivin蛋白，氨胁迫培养条件下的蛋白表达水平大约为常规分批培养的2.2倍，总的重组蛋白生产水平为大约后者的1.8倍。 另外，作者还进行了与本工作相关的大肠杆菌细胞活力检测、发酵液超氧自由基的检测等测定优化研究。作者认为细胞氧呼吸活性作为细胞活力的指标更能准确反应细胞的生理状态。羟胺氧化法检测超氧自由基优点是，在发酵液中，超氧自由基产生后即被羟胺捕捉生成较为稳定的亚硝酸根，然后发酵液通过离心和酸化后可在-20℃较长时间保存而不影响亚硝酸根的检测。 本文的主要内容与结论： (1)在这项工作中作者证明，由于供氧的限制，大肠杆菌BL21(DE3)在进入静止期之所以会高水平表达重组蛋白，是由于培养基中铵离子的积累的促进作用。 在从摇瓶到发酵罐放大过程的研究中，作者首次发现并阐明了铵离子的存在对于大肠杆菌表达重组蛋白的重要作用，并且在氨胁迫条件下成功地进行了rtPA和HIV-TAT-survivin等蛋白表达的放大。 虽然由于氧限制导致菌体代谢产生的超氧自由基水平较低，但大肠杆菌菌体内的一系列与氧化胁迫相关的酶如SOD，过氧化氢酶，谷胱甘肽还原酶等在菌体表达外源蛋白时却被高水平诱导。结合诱导后菌体氧呼吸活性下降的实验数据，作者认为在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白时，菌体可能产生一些与氧化胁迫类似的生理反应，伴随着菌体活力的降低。 (2)作者应用表达rtPA的E，coli BL21(DE3)菌株作为模式菌来详细阐明氨利用限制与重组蛋白表达的关系，以及在发酵罐上分批培养时氨胁迫提高外源蛋白表达的机理。同时作者还讨论了在常规培养模式和氨胁迫培养模式下，高浓度的乙酸分泌、重组蛋白不同表达情况下的氨代谢相关酶的活性变化规律。 在常规的分批培养模式下，菌体氨同化相关的酶活性异常升高，这提示了大肠杆菌在高密度培养时低氨限制情况下菌体的氮源饥饿状态。作者认为，在放大过程中，随着E.coli细胞的生长和外源蛋白的表达，菌体细胞在常规的分批培养模式下很可能经受着氮源利用的限制，即使在培养基中还存在丰富的酵母浸出粉和胰酪蛋白胨。 理论意义和实际应用价值： 作者发现，较好的供氧能力虽然使菌株E.coli BL21(DE3)产生乙酸浓度更高，但在本研究中抑制重组蛋白表达的关键因素并不是乙酸，而是有机氮源代谢产生的副产物——铵离子的浓度限制。在从摇瓶到发酵罐放大过程的研究中，首次阐明了培养基铵离子的存在对于大肠杆菌表达重组蛋白的重要作用，并在氨胁迫条件下成功地进行了rtPA和HIV-TAT-survivin等蛋白表达的放大。作者的研究表明，由于供氧水平增加所导致的rtPA表达水平的降低实际上是由于培养基中铵离子应用限制造成的，既使培养基中还有丰富的有机氮源，从这一点出发也为重组蛋白从摇瓶到发酵罐放大时表达水平降低的现象提供了一个新的解释。大肠杆菌表达外源蛋白的氨胁迫发酵技术的特点及其理论研究为以后的发酵过程优化提供了一个新的内容和角度，可以使我们更好的理解从摇瓶到发酵罐的放大过程中菌体的代谢特点。