本课题受到国家自然基金NO.81673618资助,旨在通过CNT2探讨菊苣提取物降尿酸作用机制。研究背景高尿酸血症全球发病率逐年增加,在我国已达到10%,在沿海经济发达城市甚至达到25%。目前,我国经济的发展、饮食的变化等因素更是加剧了高尿酸血症发病率的增长,并且高尿酸血症与痛风、代谢性疾病、心血管疾病、高血压、肾脏疾病、2型糖尿病等疾病的发生发展密切相关,已成为继高血糖、高血压、高血脂后不容忽视的第四高。高尿酸血症(Hyperuricaemia,HUA)是血尿酸水平在体内持续性升高或者血尿酸过饱和的一种病理状态。尿酸是嘌呤代谢的终产物,血尿酸水平是基于嘌呤的吸收、嘌呤的代谢以及尿酸的排泄之间的平衡,嘌呤摄入增多、嘌呤代谢紊乱、尿酸排泄减少或三者共同作用均可导致高尿酸血症的发生。临床中常用的降尿酸药物主要包括两类,抑制嘌呤代谢酶活性的药物,如非布司他、托匹司他、别嘌呤醇等;增加尿酸排泄的药物,如苯溴马隆、丙磺舒、新型URAT-1抑制剂、尿酸酶等,而目前临床上尚无作用于嘌呤吸收途径的降尿酸药物。大量流行病学研究显示富含嘌呤饮食的过量摄入是高尿酸血症发病的危险因素,并且有实验证明摄入酵母核酸仅在几天内就能诱发健康受试者血尿酸水平升高。同时有实验证明,低嘌呤饮食可使高尿酸血症患者血清尿酸水平降低。因此可以看出嘌呤摄入增加确可增加血尿酸水平,抑制其肠胃吸收可以作为防治高尿酸血症的一个作用环节。嘌呤(Purine)类物质胃肠道吸收的主要部位在小肠,吸收主要形式是核苷,核苷的跨膜运输需要依赖核苷转运蛋白。人体内核苷转运蛋白主要有两类:浓度型核苷转运体(concentrative nucleoside transporter,CNTs 或 SLC28)和平衡型核苷转运体(equilibrative nucleoside transporter,ENTs或SLC29)。CNTs是Na+依赖的富集型核苷转运蛋白,是一种主动转运蛋白,可逆浓度差将细胞外核苷转运至细胞内,主要分布在肠上皮细胞顶膜;ENTs是通过易化扩散方式转运嘧啶和嘌呤类物质,主要分布在肠上皮细胞基底外侧膜,其中,浓度型核苷转运体CNT2是肠道吸收转运嘌呤核苷的主要转运体。hCNT2是嘌呤核苷特异性转运蛋白,在胃、空肠、回肠和肾等脏器丰富表达,在小肠上皮细胞吸收嘌呤核苷的过程中,CNT2起主要作用。已有研究发现CNT2的蛋白和mRNA表达水平升高,使外源添加的核苷酸经载体转运量增加。亦有实验证实口服给予猴CNT2选择性抑制剂可通过抑制肠道嘌呤核苷的摄入显著降低血尿酸水平。同时实验室前期虚拟筛选出菊苣中含有的可与CNT2结合的咖啡酸类、黄酮类及倍半萜类等21个化合物,其中含量较高、专属性相对较强的菊苣酸可抑制IEC-6细胞CNT2对腺苷的转运。那么菊苣提取物能否通过干预CNT2的表达而影响肠道的嘌呤核苷吸收?嘌呤的过量吸收对内源性核苷酸合成途径及嘌呤的分解代谢途径的关键酶以及血清尿酸水平的影响又是如何?尚有待研究。基于这些生活与临床中的问题,提出如下假说:高尿酸血症的发病原因之一是过量的嘌呤摄入使得肠道嘌呤转运蛋白CNT2表达增多,而CNT2的表达增加又可引起肠道嘌呤吸收增加,嘌呤代谢酶活化,尿酸生成增多。健脾祛湿中药菊苣可通过对肠道CNT2的调控发挥降尿酸的作用机制。为验证此假说,本实验利用大鼠和鹌鹑两种高尿酸血症模型动物进行实验研究。研究目的第一:切入肠道嘌呤转运蛋白CNT2,从肠道嘌呤吸收角度明确HUA大鼠和鹌鹑CNT2表达与高尿酸血症发病的病理联系,并结合嘌呤代谢途径关键酶活性进一步阐释两种模型动物的病理表现。第二:通过分析菊苣提取物对高尿酸血症大鼠及鹌鹑肠道CNT2、嘌呤代谢途径关键酶的影响,以及菊苣提取物对HUA鹌鹑空肠外翻肠囊转运腺苷的干预,探讨其降尿酸可能的干预环节和作用机制。研究方法本论文包括文献综述研究和实验研究两部分。文献综述部分通过查阅国内外近十年文献,对高尿酸血症流行病学特征、发病机制、中医药治疗的研究进展以及肠道嘌呤转运蛋白的研究进展及其与高尿酸血症的关联进行梳理,为后续实验研究提供理论与方法基础。实验研究部分采用病因诱导法复制动物模型,利用高嘌呤食饵一定剂量的酵母诱导的HUA鹌鹑模型,利用同大鼠模型相同剂量的酵母合用小剂量腺嘌呤诱导HUA大鼠模型。结合生化检测、实时荧光PCR、Western Blotting、免疫组化、高效液相等实验手段,从整体动物、器官、组织、分子多层面对嘌呤转运蛋白CNT2病理状态下的表达变化进行研究,阐释菊苣提取物对于两种模型动物血清尿酸水平、嘌呤代谢酶活性、嘌呤吸收量、CNT2蛋白、mRNA表达量等的干预作用。实验研究内容分为两个章节。第一章高尿酸血症状态下模型动物小肠CNT2的表达研究结合实验室前期基础及文献检索结果,选择嘌呤摄入增多为诱因的高尿酸血症大鼠模型,筛选造模剂剂量,复制高尿酸血症大鼠模型,观察高尿酸血症大鼠血尿酸水平、大鼠肠道CNT2表达变化。复制高嘌呤食饵诱导的高尿酸血症鹌鹑模型,检测其小肠CNT2的表达变化,探讨高尿酸血症状态下CNT2的表达变化,为后续药理药效研究奠定基础。第二章探讨菊苣提取物对高尿酸血症大鼠、鹌鹑小肠CNT2表达的影响在病理研究的基础上,明确菊苣提取物对高尿酸血症大鼠、鹌鹑小肠CNT2mRNA及蛋白表达的干预,探讨菊苣提取物对高尿酸血症大鼠、鹌鹑嘌呤代谢关键酶的影响,以及菊苣提取物对HUA鹌鹑空肠外翻肠囊腺苷转运的干预,阐释菊苣提取物降尿酸可能的作用环节及机制。研究结果高尿酸血症状态下模型动物小肠CNT2的表达研究结果显示:①一定剂量酵母联合腺嘌呤诱导的高尿酸血症大鼠模型、高嘌呤食饵诱导的高尿酸血症鹌鹑模型的血清尿酸水平持续稳定的升高,模型比较稳定。②与正常组相比,高尿酸血症大鼠十二指肠、空肠、回肠的CNT2 mRNA相对表达量均增加,其中空肠的CNT2 mRNA表达增加显著。③与正常组相比,高尿酸血症鹌鹑空肠CNT2蛋白相对表达量显著增加。菊苣提取物对高尿酸血症大鼠、鹌鹑的小肠CNT2表达的干预结果显示:①菊苣提取物可稳定降低模型动物的血清尿酸水平、血清及肝脏中嘌呤代谢酶活性。②菊苣提取物可显著下调高尿酸血症大鼠CNT2 mRNA、蛋白相对表达量,显著下调高尿酸血症鹌鹑CNT2蛋白相对表达量。③肠囊外翻实验中菊苣提取物可降低高尿酸血症鹌鹑空肠底物的转运量。研究结论1.HUA大鼠、鹌鹑肠道嘌呤转运蛋白CNT2相对表达量上调与血清尿酸水平升高存在病理联系。2.中药菊苣的成分可与CNT2结合,干预小肠CNT2的相对表达量,及肠道嘌呤的吸收转运。菊苣提取物可显著下调高尿酸血症大鼠肠道嘌呤转运蛋白CNT2mRNA及蛋白表达、高尿酸血症鹌鹑肠道CNT2蛋白表达,减少模型动物肠道嘌呤吸收,降低嘌呤代谢酶活性,从而达到降尿酸的作用机制。创新点:1.从嘌呤吸收的角度切入,探讨高尿酸血症大鼠、鹌鹑两种动物模型HUA与肠道嘌呤转运蛋白CNT2的相对表达量的病理联系。2.发现菊苣提取物降尿酸的作用机制之一是显著下调模型动物肠道CNT2的相对表达量,减少嘌呤吸收。