茅苍术(Atractylodes lancea(Thunb.)DC.)为多年生菊科植物,以根茎入药,具有燥湿健脾,祛风明目等功效。茅苍术为江苏省道地药材,以产自茅山一带的质优。由于其自身的生物学特性以及各种人为因素的破坏,其种群恢复能力日渐下降,分布地区及种群数量呈现出明显的衰退现象,被列为江苏省4种濒危药用植物之一。苍术中主要的药效成分为倍半萜类成分,具有多种药理活性,植物中的倍半萜主要是通过MVA途径生成。目前对于苍术倍半萜形成的分子机制研究甚少。本文主要构建了茅苍术根茎及叶的转录组数据库,对其生物合成路径进行了预测,对其生物合成途径中的两条关键酶进行克隆分析,探究了茉莉酸甲酯对茅苍术的生理生化影响及对关键酶的调控作用,愈伤组织体系的构建等工作。主要包括以下几个方面的内容:(1):建立了茅苍术根茎及叶的转录组学平台,本次茅苍术转录组学研究中,通过拼接组装得到了 126072条unigenes,注释率达到45.56%。获得了 84条与茅苍术萜类骨架生物合成相关的unigenes;50条与萜类下游途径合成相关的unigenes,其中与单萜合成相关的有9条,与三萜倍半萜合成相关的有24条,与二萜合成相关的有17条。基因差异表达分析表明,茅苍术根茎及叶中表达量上调的基因多与其自身生长特点有关,与倍半萜生物合成有关的关键酶在根茎及叶中的表达有较为明显的差异:在萜类骨架合成路径上,关键酶AACT,HMGS,HMGR,PMK,GPS在根茎中的表达量显著高于叶中;在下游产物合成途径中,根茎中表达量上调的基因为倍半萜合酶基因,叶中表达量上调的基因多为三萜合酶基因,表明与倍半萜合成相关的关键酶主要分布在根茎中。此外本研究还发现了 35条参与萜类物质合成后修饰的候选P450及8条可能参与调控倍半萜合成的候选转录因子,有助于揭示其在茅苍术倍半萜生物合成路径中的调控作用机制。(2):利用RACE技术克隆得到了茅苍术Al-sesl全长cDNA。生物信息学分析表明,该cDNA序列全长为2018bp,包含1个长度为1644bp的开放阅读框,编码547个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明与洋甘菊的相似度为72%。结构域分析表明其含有2个倍半萜合酶共同的保守域,分别为RRX8W和DDXXD。进化树分析表明,Al-ses1归属于TPSa家族,为典型的倍半萜类合酶。荧光定量结果显示,Al-ses1在根茎表达量最高,推测其调控根茎中倍半萜类成分的合成。(3):克隆得到了茅苍术AlHMGR的全长cDNA。对AlHMGR进行生物信息学分析结果显示cDNA的全长为2149bp,其开放阅读框全长为1752bp,编码583个氨基酸。对AlHMGR进行理化分析表明,该基因编码的蛋白Mr为62689.4,pI为7.47,为疏水性蛋白。进化树分析表明AlHMGR为典型的HMGR家族酶,且与菊科植物HMGR亲缘关系较近。QRT-PCR结果显示,该基因在根茎中表达量高于其他组织部位。(4):利用茉莉酸甲酯刺激茅苍术并进行生理生化指标测定及关键酶表达分析,结果表明茉莉酸甲酯可以触发茅苍术的防御体系,诱导防御体系中POD、CAT两种酶活性的增加,并抑制SOD酶的活性;MeJA可以调控茅苍术MVA合成途径中关键酶HMGR、AlFPPS、AlHMGR及AlSES的瞬时高表达。说明MeJA处理茅苍术后,可以启动其防御机制导致与防御有关的关键酶表达量升高,对关键酶的表达具有调控作用。(5):在前人研究的基础上,设计正交试验,优化了生长激素配比并建立了稳的茅苍术愈伤组织反应体系。实验结果表明:消毒15min可以有效消灭种子表面的细菌,获得生长较好的无菌苗,但同时也会影响种子的萌芽率。茅苍术外植体形成愈伤组织的最佳激素配比为1.0mg/L2,4-D,0.1mg/L6-BA和0.2mg/LNAA,在该组合培养基上进行愈伤时,外植体的愈伤诱导率最高。