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第一部分人参皂苷体外抗炎抗氧化作用的研究目的:通过体外实验检测人参皂苷Rh2(GRh2)、人参皂苷Rg1(GRg1)及人参皂苷Rg3(GRg3)对脂多糖(LPS)诱导的外周血单个核细胞(PBMC)形成肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)及一氧化氮(NO)的表达变化,了解三种人参皂苷的抗炎、抗氧化作用并进行对比,筛选出抗炎抗氧化综合效果作用最强的人参皂苷单体,为后续实验提供理论依据。材料和方法:采集健康志愿者静脉血,取PBMC进行分离培养,向96孔板中分别加入3μM的人参皂苷Rh2、Rg1及Rg3进行预处理,培养1h后加入100ng/ml的LPS,诱导PBMC出现炎症反应,24h后吸取细胞上清液,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组中TNF-α、IL-1β及NO的浓度。结果:LPS处理PBMC后,上清液中TNF-α、IL-1β及NO的浓度较对照组均显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。人参皂苷Rh2、Rg1及Rg3预处理均可降低上清液中TNF-α、IL-1β及NO的表达(P<0.05),对上清液中TNF-α的表达,下降趋势为GRg3>GRg1>GRh2;对于上清液中IL-1β的表达,下降趋势为GRg3>GRh2及GRg1;而对于上清液中NO的表达,下降趋势为GRg3及GRh2>GRg1。结论:人参皂苷Rh2、Rg1及Rg3预处理均可降低LPS诱导的PBMC中TNF-α、IL-1β及NO的浓度,但人参皂苷Rg3在体外抗炎抗氧化的综合作用强于人参皂苷Rh2、Rg1。第二部分脂多糖诱导小鼠急性肺损伤自我消退模型的建立及环氧合酶2表达的研究目的:研究气管内灌注LPS诱导小鼠急性肺损伤(ALI)的疾病特点及转归过程,了解环氧合酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)在ALI中的表达变化,为后续实验提供理论依据。材料和方法:雄性SPF级BALB/c小鼠78只,6~8周,体重16~20g,将动物随机分为以下3组:零点组,对照组和急性肺损伤组。以气管内滴注10μg/50μl脂多糖建立小鼠ALI模型,对照组小鼠气管内滴注等体积生理盐水。零点组在实验开始时立即处死。对照组及ALI组小鼠在给药刺激6h、12h、1d、2d、4d、7d后分别随机处死。评估各组小鼠肺组织病理情况、湿干重比值及髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)评分。收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)进行细胞计数,ELISA检测BALF中TNF-α、IL-1β的表达变化。RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)检测小鼠肺组织COX-2m RNA的表达情况。结果:1.各时间点对照组小鼠肺组织的病理学无明显变化,ALI组小鼠出现肺泡结构破坏、间隔增厚,肺泡腔内炎症细胞浸润,这些现象在12h最明显,之后逐渐减轻;急性肺组织评分在12h达峰值,之后逐渐下降,至7d肺组织基本恢复正常。2.各时间点ALI组小鼠肺组织湿/干重比值均较对照组明显升高,其比值在LPS刺激12h达高峰,随后逐渐下降。3.ALI组MPO活性自LPS诱导6h到1d呈上升趋势,之后呈下降趋势。4.ALI组小鼠BALF中总细胞数目在1d时达峰值,随后下降。5.急性肺损伤组BALF中TNF-α及IL-1β在1d达最高值,之后逐渐下降。6.ALI组小鼠肺组织COX-2 m RNA的表达自6h到12h呈上升趋势,自12h至7d呈下降趋势。结论:气管内滴注LPS可以成功诱导小鼠急性肺损伤模型,ALI组小鼠病理学变化、湿/干重比值及COX-2 m RNA在LPS诱导12h达最高值,肺组织MPO评分、BALF中总细胞数目、TNF-α及IL-1β水平在1d达峰值,之后逐渐下降,在无干预因素时,LPS诱导的小鼠ALI模型可实现自我消退,在LPS刺激第7天基本恢复正常。第三部分人参皂苷Rg3对LPS诱导急性肺损伤小鼠的保护作用与机制的研究目的:以气管内滴注LPS诱导小鼠ALI模型,并用不同剂量的人参皂苷Rg3(GRg3)进行干预,观察GRg3对急性肺损伤的保护作用,并分析其对炎症及氧化应激中相关基因和蛋白的表达,进一步了解GRg3在急性肺损伤中发挥保护作用的机制。材料和方法:雄性SPF级BALB/c小鼠72只随机分为以下6组:对照组、GRg3(30mg/Kg)组、LPS组、LPS+GRg3(10mg/Kg)组、LPS+GRg3(20mg/Kg)组、LPS+GRg3(30mg/Kg)组。GRg3以尾静脉注射的方式进行给药,连续2天,第2次注射后以气管内滴注LPS建立小鼠ALI模型。评估各组小鼠肺组织病理情况、湿干重比值及MPO评分。收集BALF进行细胞计数,ELISA检测小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的表达变化。Western-Blot检测小鼠肺组织NF-κB p65、i NOS、COX-2蛋白表达水平。Real Time-PCR检测肺组织i NOS、COX-2 m RNA的表达情况。评估肺组织NF-κB p65DNA结合力的情况。结果:1.LPS组小鼠肺组织病理学损伤程度、湿/干重比值及MPO评分较对照组及GRg3组明显升高(P<0.05)。不同剂量的GRg3预处理均可减轻ALI小鼠肺组织的病理损伤程度,降低肺组织湿/干重比值及MPO评分(P<0.05),且呈剂量依赖性。2.与对照组及GRg3组相比,LPS组小鼠BALF中总细胞、中性粒细胞及巨噬细胞数目均明显增加(P<0.05)。不同剂量的GRg3组较LPS组小鼠BALF中总细胞、中性粒细胞及巨噬细胞数目均明显降低,并呈剂量依赖性(P<0.05)。3.LPS造模后,小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO表达较对照组及GRg3组明显升高(P<0.05)。而应用不同剂量的GRg3预处理可降低BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的表达,并呈剂量依赖性(P<0.05)。4.与对照组及GRg3组相比,LPS组小鼠肺组织phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65蛋白表达比值、NF-κB p65 DNA结合能力、i NOS、COX-2的蛋白及m RNA水平均明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。应用不同剂量的GRg3预处理后,小鼠肺组织phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65蛋白表达比值、NF-κB p65 DNA结合能力、i NOS和COX-2的蛋白及m RNA表达水平均明显下降,并表现为剂量依赖性(P<0.05)。结论:1.在急性肺损伤中,LPS可能通过引起小鼠肺组织NF-κB p65的磷酸化、COX-2及iNOS的表达增加诱导炎症反应及氧化应激,从而诱发急性肺损伤的形成。2.GRg3可能通过抑制小鼠肺组织NF-κB p65的磷酸化、COX-2及i NOS的表达发挥抗炎抗氧化作用从而对LPS诱导的急性肺损伤发挥保护作用。