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心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)在多种心血管疾病中存在，炎症、缺血、免疫、高血压等引起的心肌损害，如果病变持续，终将导致心肌纤维化的发生。MF与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死等密切相关，目前尚无满意的治疗方法。缺乏对MF发生、发展分子机制的全面认识是影响疗效的重要原因之一。对MF发生、发展胞内信号转导机制的研究有助于进一步深入探讨MF的发病机制以及寻找治疗MF的新靶点。
本研究分别以体外培养的新生大鼠心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts，CFs)和结扎冠脉前降支的心肌梗死(myocardial infarction，MI)大鼠为实验模型，通过观察血管紧张素Ⅱ刺激后CFs及MI后大鼠非梗死区心肌中RhoA/ROCKs的表达和活性变化，并观察ROCKs抑制剂对血管紧张素Ⅱ诱导的CFs增殖、胶原合成和MI后4周非梗死区MF的影响，旨在探讨RhoA/ROCKs信号通路在MF发病机制中的作用，为MF的防治提供新的思路和实验依据。
第一章新生SD大鼠心肌成纤维细胞的原代培养及鉴定。
目的：构建新生SD大鼠心肌成纤维细胞原代培养模型。
方法：采用胰酶消化和差速贴壁法分离新生SD大鼠CFs，采用倒置显微镜、HE染色和免疫细胞化学染色进行鉴定。
结果：
1.倒置显微镜下，原代培养的CFs呈梭形或不规则三角形，胞质淡而几乎透明，细胞核较大，呈椭圆形，无自发性搏动；
2. HE染色后光镜下观察：细胞核呈蓝紫色，细胞浆呈粉红色，对比鲜明，细胞形态更加清晰；
3.免疫细胞化学染色结果：波形蛋白染色阳性，血管平滑肌肌动蛋白染色呈阴性，PBS对照呈阴性，符合成纤维细胞的染色特征。免疫组化鉴定为所需的CFs，纯度达95﹪。
结论：采用胰酶消化、差速贴壁法成功原代培养出新生SD大鼠CFs；经倒置显微镜、HE染色和免疫细胞化学染色证实本实验所培养的细胞确为CFs，且纯度达95﹪。
第二章RhoA/ROCKs信号通路对Ang Ⅱ刺激心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的调控作用。
目的：了解AngⅡ促CFs增殖和胶原合成效应；了解新生SD大鼠CFs中RhoA/ROCKs表达情况并探讨RhoA/ROCKs信号通路在调控Ang Ⅱ刺激CFs增殖和胶原合成中的作用。
方法：采用四氮唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖活力，羟脯氨酸法测定培养上清胶原含量，RT-PCR、Western blot等分子生物学技术检测CFs中RhoA、ROCK1、ROCK2表达情况，Westem blot检测肌球蛋白结合亚基磷酸化(phosphor)，lationof myosin-binding subunit，P-MBS)表达作为ROCKs功能活化的标志。
结果：
1.Ang Ⅱ(10<-8>～10<-6>mol/L)刺激CFs 24小时后，平均吸光度值均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)；胶原合成量亦均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，并呈剂量依赖性；
2.予10<-7>mol/L AngⅡ刺激CFs，在48h内，随着刺激时间的延长，平均吸光度值及胶原合成量逐渐增高；
3.单用培养基孵育的对照组CFs中，RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的表达量分别为(0.32±0.07，0.24±0.05，0.27±0.06)，；予10<-7>mol/L AngⅡ刺激CFs 12h、24 h、48 h后，CFs中RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达量均较对照组增高，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，高峰时间为24h。
4.单用培养基孵育的对照组CFs中， ROCK1、ROCK2蛋白的表达量分别为(0.19±0.02。0.21±0.02)，；予10<-7>mol/L AngⅡ刺激CFs 12h、24 h、48 h后，CFs中ROCK1和ROCK2蛋白表达量均较对照组增高，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，高峰时间为24h。
5.单用培养基孵育的对照组CFs中， ROCKs的活性水平极低，；10<-7>mol/LAng Ⅱ刺激CFs 1h后即可诱导ROCKs活化(P<0.05)，24h左右达峰值(p<0.01)，至72h，ROCKs活性仍高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。
6.予ROCKs的特异性抑制剂Hydroxyfasudil(H4413 10<-4> mol/L)预处理6h后再用10<-7>mol/L Ang Ⅱ刺激CFs，H4413+Ang Ⅱ组ROCKs活性水平显著低于AngⅡ刺激组(P<0.01)，而与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)；同时，H4413+Ang Ⅱ组平均吸光度值和胶原合成量均低于Ang Ⅱ刺激组，差异有统计学意义(P<0.01)；单用H4413预处理而未加用Ang Ⅱ刺激组平均吸光度值和胶原合成量与对照组间差异无统计学意义。
结论:
1.Ang Ⅱ具有促进CFs增殖活力和胶原合成作用，并呈剂量和时间依赖性；
2.基础状态下，新生SD大鼠CFs中存在RhoA/ROCKs mRNA和蛋白表达，但ROCKs活性水平较低；
3.在新生SD大鼠CFs，AngⅡ可增加RhoA/ROCKs mRNA和蛋白表达，诱导ROCKs快速活化；ROCKs特异性抑制剂H4413可显著抑制Ang Ⅱ刺激的CFs增殖和胶原合成。RhoA/ROCKs信号通路在Ang Ⅱ刺激CFs增殖和胶原合成中可能起重要作用。
第三章大鼠MI后非梗死区心肌RhoA/ROCKs的表达变化及ROCKs特异性抑制剂fasudil干预.
目的:了解MI后大鼠非梗死区心肌RhoA/ROCKs的表达变化；观察ROCKs特异性抑制剂fasudit对MI后大鼠非梗死区心肌纤维化的影响。
方法:采用冠状动脉结扎法建立大鼠MI模型，术后48h存活的大鼠随机分为MI组(n=14)和MI+fasudil(10mg/kg/d)组(n=14)，另设假手术对照组(n=10)。4周后，①检测心肌梗死面积；②通过组织病理切片的HE、VG和masson染色观察MI后非梗死区(NIZ)心肌组织形态和胶原沉积；③检测NIZ心肌心肌胶原容积分数(CVF)、羟脯氨酸含量(HC)和胶原含量(CC)变化；@RT-PCR检测NIZ心肌中RhoA、ROCK1、ROCK2、collgen Ⅰ和collgen Ⅲ mRNA的表达；⑤Western blot检测NIZ心肌中ROCK1、ROCK2和P-MBS表达。
结果:
1．sham组、MI组、MI+fasudil组4周后存活的大鼠分别为：10、11、13只：MI组、MI+fasudi组大鼠心肌梗死面积差异无统计学意义(p>0．05)。
2．Sham组心肌结构清楚，排列整齐，胶原沉积较少； MI组NIZ心肌细胞出现代偿性肥大，排列较混乱，胶原沉积较明显；MI+fasudil组NIZ心肌组织与sham组问差异不甚明显。
3．MI组NIZ心肌CVF、HC和CC高于sham组，差异有统计学意义(p均<0．01)；MI+fasudil组上述指标低于MI组，差异有统计学意义(p均<0．01)，与sham组间差异无统计学意义(p>0．05)。
4．MI组NIZ心肌RhoA、ROCK1、ROCK2、collgen Ⅰ和eollgen Ⅲ mRNA表达均高于sham组，差异有统计学意义(p均<0．01)，且RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA表达与collgen Ⅲ mRNA表达间呈明显正相关(p均<0．05)；MI+fasudil组collgen Ⅰ和collgen Ⅲ mRNA表达均显著低于MI组(p<0.01)，与sham组问差异无统计学意义(p>0.05)。
5.MI组NIZ心肌ROCK1、ROCK2的蛋白表达均高于sham组，差异有统计学意义(p均<0.01)；MI+fasudil组NIZ心肌ROCK1、ROCK2的蛋白表达与MI组间差异无统计学意义(p均>0.05)。
6.MI组NIZ心肌，ROCKs活性高于sham组，差异有统计学意义(P<0.01)，且ROCKs活性与CC间呈显著正相关(r=0.937，P<0.01)；MI+fasudil组NIZ心肌ROCKs活显著低于MI组(p<0.01)，与sham组间差异无统计学意义。
结论；
1.MI后4周大鼠非梗死心肌RhoA/ROCKs表达与活性异常增高；且RhoA、ROCK1和ROCK2 mRNA表达与Ⅲ型胶原mRNA表达水平间有明显正相关关系，ROCKs活性与CC间亦有显著的正相关关系。
2.RhoA/ROCKs通路抑制剂fasudil可明显抑制MI后非梗死区心肌纤维化，其机制与抑制ROCKs的活化，下调Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达有关.
3.RhoA/ROCKs通路在MI后非梗死区心肌纤维化的发病机制中可能具有重要作用，确切的调控机制及其抑制剂对心肌纤维化的干预效果仍有待进一步研究。