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目的:结节病是一种病因不明多系统多器官的免疫肉芽肿性疾病。发病年龄波动25~40岁,发病率0.85~2.4%。由于疾病的复杂性,以往对疾病发病机制的研究尚无明确定论,需要用新的技术手段来进一步研究。基因芯片技术(gene chiptechnology),又称cDNA微阵列技术(cDNA microarray technology),可同时检测成百上千个基因的表达。自从九十年代初美国Afymetrix公司首先开展基因芯片技术以来,该技术已被成功地应用于基因功能研究的各个领域,进行的大规模基因表达已成为研究病理生理过程的卓有成效的研究方法。对于肺结节病发病机制的复杂性,基因芯片技术使这种在复杂的背景中捕捉微小差异的研究成为可能。目前国外仅少数文献报道利用基因芯片技术比较了肺结节病和正常人之间的差异表达基因。本研究旨在通过含15553个检测点基因表达谱芯片检测肺结节病与正常对照组之间的差异表达基因,以期发现一些新的与肺结节病发病相关的基因,总结出与此种疾病可能有关的基因变化及相关的信号转导通路;并对其中的部分基因用RealtimePCR,免疫组织化学等方法进行验证,分析这些基因的功能,以进一步阐肺结节病发病机制,并为将来临床诊断、治疗提供新的靶点。
资料和方法:
1、资料
8例肺结节病患者均来源于中国医科大学附属第一医院呼吸科病房住院患者(2006年4月至2006年12月),男3例,女5例,年龄33~54岁,经过临床,影像学,组织病理学诊断,符合结节病诊断标准。8例对照组:男4例,女4例,年龄35~52岁,因有咽部异物感等而要求行纤维支气管检查,经胸部X线、肺功能及纤维支气管镜检查均无异常的非吸烟者。另外收集中国医科大学呼吸病研究所历年积攒的肺结节病患者病理蜡块11例,7例对照组来源于外科手术切除肺组织,病理结果符合正常肺组织。
2、支气管肺泡灌洗液收集两个实验组均经支气管肺泡灌洗(BAL),收集肺泡灌洗液(BALF),将BALF过滤,4℃低温离心去上清,细胞成分经Trizol处理,液氮保存。
3、基因芯片
将上述2组肺泡灌洗液中总RNA提取后,各选择3例逆转录成cDNA,掺入荧光标记,与芯片杂交,经过洗片、信号检测、微阵列图像分析、计算机软件数据处理,将所得的数据进行比较,得到二者间基因表达的差异信息。
4、RealtimePCR8例肺结节病患者和对照组的支气管肺泡灌洗液,用于RealtimePCR实验。设计并合成CCL16,ADAM9引物,抽提肺泡灌洗液总RNA,RealtimePCR定量检测CCL16,ADAM9mRNA表达量。
5、免疫组织化学对照组和结节病组肺组织蜡块经切片,参照二步法免疫组织化学试剂盒步骤测定CCL16,ADAM9表达。
6、免疫荧光
对照组和结节病组的组织切片做CCL16,ADAM9免疫荧光染色,荧光显微镜观察并照相。
结果:
1、基因芯片结果在进入研究的15553条基因中,有305条基因存在差异表达,其中表达增加的基因有116条,表达降低的基因有189条,涉及细胞因子及其受体、细胞粘附分子、酶调节活性、催化活性、结构分子活性、信号转导活性,转录翻译调节、运载体活性等许多方面。
2、RealtimePCR结果肺结节病组CCL16的mRNA表达水平高于对照组,两组比较差异有统计学意义(t=7.07,P<0.001)。肺结节病组ADAM9的mRNA表达水平明显低于正常对照组,两组比较差异有统计学意义(t=23.3,P<0.001)。
3、免疫组化结果CCL16呈棕黄色沉积在肺结节病肉芽肿及周边肺组织的类上皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞胞核中,对照组肺泡间隔仅见CCL16少量表达。ADAM9大量沉积在正常肺组织的肺泡壁上皮细胞和肺泡腔内巨噬细胞胞膜和胞质,呈棕黄色。而肉芽肿及周边的肺组织内未见明显沉积。
4、免疫荧光结果CCL16定位表达在肺结节病肉芽肿组织的淋巴细胞、巨噬细胞、类上皮细胞胞核。而ADAM9定位表达在巨噬细胞,上皮细胞的胞质和胞膜。
结论:通过基因芯片技术发现肺结节病患者与正常对照组之间存在305条差异表达基因,其中上调表达116条,下调表达189条。对差异表达基因功能的深入研究将有助于揭示基因复杂调控网络在肺结节病发生发展中的作用,明确其发病机制,从而为诊治提供新思路。CCL16和ADAM9的表达通过RealtimePCR和免疫组化得到验证。表明CCL16和ADAM9在肺结节病的发生发展起着重要作用,本研究工作为研究结节病的发病机制提供了新的方向和靶点。