目的:创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）是全世界健康损失和残疾的主要原因。在全球范围内,TBI的年发病率有所差异,估计病例在2700万-6900万例。许多幸存者遗留显著残疾,造成了很大的社会经济负担。创伤会导致直接的机械性组织损伤（即原发性损伤）以及导致延迟或进行性细胞损失（即继发性损伤）的生化变化。所以,当前临床处理TBI的方法围绕上述两方面的原理而开展。手术治疗是TBI尤其是重度TBI患者针对原发性脑损伤治疗的核心。同样,对继发性脑损伤的识别、预防和治疗也是TBI患者监护治疗的重点。TBI继发性损伤导致的细胞损伤和死亡常与恢复阶段重叠,在此期间脑组织重塑自身以补偿组织损伤,因此提供了治疗的机会。这些修复机制包括内源性神经前体的增殖和分化、神经突生长和髓鞘再生的刺激以及血管生成等。除上述机制外,在TBI的继发性损伤中也观察到自噬的现象。既往的尸检以及TBI鼠模型研究中已发现,自噬小体的积累是TBI继发性损伤的早期事件,在受伤后数小时内即已出现。而且自噬标志物在受伤后数周至数月内仍保持升高。这种自噬功能持续的上调更说明其重要作用。因此,如何诱导自噬的发生以及修复自噬流,是治疗TBI继发性损伤的潜在的治疗方法。汉防己甲素（tetrandrine,Tet）又称为粉防己碱,是从防己科植物粉防己（Stephamia tetrandra S.Moore）块根中提取的双苄基异喹啉类生物碱,属于双苄基异喹啉类化合物,为新型钙拮抗剂。大量研究表明,Tet具有广谱药理活性,包括抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗抑郁、抗风湿性关节炎、抗微生物和改善记忆等功能。Tet主要多种信号通路调控肿瘤细胞的凋亡和自噬发挥显着的抗癌活性。在神经系统疾病领域,Tet对血管性痴呆的神经保护作用;Tet也可以减轻亚急性期神经元的缺血/再灌注引起损伤;Tet可以缓解大脑中动脉缺血再灌注模型鼠的神经缺陷、改善脑含水量及减少梗死体积。Tet可以作用于P-糖蛋白,影响血脑屏障的通透性,并且Tet血脑屏障的透过性良好。最近研究表明Tet在急性期（7天内）可通过调节自噬减少铁死亡,改善TBI症状,同时Tet也可以减轻实验性创伤性脑损伤炎症和神经元凋亡。综上,Tet在可通过多种机制进行神经功能保护,在神经系统疾病治疗上具有极大的潜力。本项研究的相关内容将进一步为Tet治疗TBI的疗效及具体机制提供重要的实验依据。方法:1.Tet潜在作用位点的预测:（1）通过网络药理学分析将Tet和TBI的65个共同目标进行组分-目标-疾病（content-target-disease,CTD）相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用（Protein protein intraction,PPI）网络,获得Tet潜在作用位点蛋白激酶B（AKT/PKB,protein kinase B）及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）;（2）使用分子对接技术对AKT、m TOR与Tet结合方式及结合能进行预测及计算,获得了AKT及m TOR均有良好的对接效果;2.SH-SY5Y细胞系缺糖/缺氧剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）实验,模拟神经元细胞在外伤压力下的改变,观察Tet的加入对细胞自噬功能的影响,同时加入自噬通路相关的抑制剂（3-MA,MK2206,rapamycin）验证Tet的作用靶点,检测包括Western Blot（蛋白印记）检测微管相关蛋白轻链3BII/1（light chain 3,LC3BII/I）,Bcl-2同源结构域蛋白（beclin1）及自噬受体蛋白（SQSTM1,p62）和AKT/p-AKT（磷酸化AKT）和m TOR/p-m TOR（磷酸化m TOR）作用位点的验证,以及红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein,m RFP）-绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）-LC3双荧光检测自噬小体等,PCR检测SQSTM1（Sequestosome 1）RNA转录表达;3.动物实验:（1）通过控制性皮层打击法制作TBI模型鼠;（2）设置对照组、假手术组及Tet不同剂量组等7组,每组6只,饲养28天,观察（0天,1天,3天,7天,14天,28天）神经行为学评分及第23-28天进行水迷宫实验对认知做出评价,第28天,处死鼠进行脑组织取材;（3）包埋切片后,进行苏木素伊红（HE）及尼氏（Nissl）染色,观察海马CA1区的损伤及完整神经元的比例;（4）Western Blot检测LC3B II/LC3B I,beclin1及p62等自噬指标和AKT/p-AKT和m TOR/p-m TOR作用位点的验证;（5）LC3荧光定位,检测自噬小体;4.统计学分析:使用Graph Pad Prism 9.3软件（Graph Pad,Inc.,La Jolla,CA,USA）进行统计分析及做图。每项实验至少独立重复3次。测量的数据以均数±标准差表示。对于两组独立正态分布的样本数据分析采用t检验;对于不属于正态分布数据使用Mann-Whitney非参数检验;同时,采用非参数χ2检验来分析定性数据。每项分析的P值都标在数字上,统计学意义水平被定义为P＜0.05（*P＜0.05;**P＜0.01;***;P＜0.001;ns p≥0.05）。结果:1.使用网络药理学及分子对接的方法,筛选出Tet作用靶点98个,TBI相关靶点2022个,共同靶点65个,提示AKT及m TOR是核心作用位点。分子对接提示Tet与AKT及m TOR对接良好,是潜在的作用位点;2.细胞实验提示Tet通过抑制m TOR磷酸化上调OGD处理后的SH-SY5Y细胞系自噬功能及修复自噬流:（1）CCK8实验得到SH-SY5Y细胞系的IC50为16.09μmol/L,OGD下Tet最适药物浓度为5μmol/L;（2）OGD处理后,SH-SY5Y细胞自噬功能上调。加入Tet后,显著上调自噬功能,修复自噬流。Tet对AKT的磷酸化无显著影响,对m TOR的磷酸化影响显著且有统计学意义,提示Tet通过抑制m TOR的磷酸化上调自噬功能;3.动物实验提示Tet通过抑制m TOR磷酸化上调神经元细胞自噬,起到神经元保护作用,具体作用具有时间依赖性及剂量依赖性:（1）从造模成功的第7天开始,14天和28天改良神经行为学评分（modified Neurological Severity Score,m NSS）提示中剂量组（30mg/kg）及高剂量组（60mg/kg）Tet有明确的改善TBI模型鼠神经功能障碍的作用,而低剂量组治疗效果无显著统计学差异,说明Tet治疗TBI有明确的改善TBI模型鼠神经功能障碍的疗效,但具有时间依赖性及剂量依赖性;（2）脑组织切片中HE染色可以看到损伤面积实验组明显小于模型组,同时尼氏染色完整神经元的比例实验组明显优于模型组,说明Tet具有神经元保护的作用;（3）海马区域的创伤脑组织进行Western Blot和LC3荧光检测,加入Tet后,实验组对比模型组自噬上调更加显著,结合LC3荧光可见实验组的自噬小体数量明显多于模型组及假手术组,说明Tet在动物模型中可以明显促进神经元自噬功能的上调,修复自噬流。结论:自噬功能上调是神经元应对TBI等外界压力的非常重要的保护反应,但实际上TBI后神经元自噬流受损是常见现象,进而导致神经元无法应对外界压力,最终诱导神经元凋亡、坏死或者铁死亡等。Tet可以通过抑制m TOR的磷酸化,上调自噬功能及修复自噬流,起到神经元的保护作用。Tet治疗TBI具有时间依赖性和剂量依赖性。Tet在TBI的急性期、亚急性期及慢性期均有神经保护作用及在慢性期可能具有改善认知的功能。