目的:血管性痴呆(vascular dementia, VD)由于各种脑血管病引起的获得性认知功能障碍,以学习、记忆功能缺损为主要症状。随着社会人口的日益老龄化和脑卒中治愈率的不断提高,VD的发病呈迅速增长趋势,成为严重危害老年人身心健康的常见疾病,给社会和家庭带来沉重的负担。目前VD的发病机制尚未明确,也无特效的防治方法,因此探讨和阐明VD的发病机理,对于临床制定更加合理的治疗方案具有重要的价值和理论意义。学习和记忆是大脑的高级功能之一。学习是指经验及技能的获得,记忆是经验及技能的保存及再现,它们是两个不同而又密切联系的神经生物过程。目前认为,海马是参与学习和记忆的重要结构,其神经元形态、结构正常与否对学习、记忆的形成和维持具有重要意义。中枢胆碱能系统参与调节哺乳动物神经元的兴奋性、皮质可塑性以及学习记忆过程,与脑认知功能密切相关。其由能够合成乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)的神经元组成。基底前脑隔内侧核和Broca斜角带核的胆碱能神经元是海马胆碱能纤维的主要来源,其释放递质ACh至海马,参与学习、记忆的形成。胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferase, CHAT)是合成ACh过程中的限速酶。脑组织缺血缺氧影响CHAT的分布与含量,从而引起ACh的改变。丁苯酞(dl-3n-butylphthalide,NBP)系从食用植物芹菜籽中提取并经消旋合成的黄色油状液体。该药为国家治疗脑缺血的一类新药,国外对该药的研究尚未见报道,国内冯亦璞等对丁苯酞治疗脑缺血的相关机制做了大量的实验研究,发现丁苯酞具有多靶点抗脑缺血作用,能改善线粒体功能,提高脑血管内皮NO和PGI2的水平,抑制谷氨酸释放,降低细胞内钙浓度和花生四烯酸含量,抑制自由基和提高抗氧化酶活性,减轻脑缺血所致脑水肿,抗血栓形成和抗血小板聚集,缩小脑梗死面积,改善局部脑血流量和细胞能量代谢、神经功能缺失及脑缺血记忆障碍。作为一种抗脑缺血新药,丁苯酞已广泛应用于脑血管病的治疗,但该药对VD的实验研究尚未见相关报道。基于此,本实验通过建立VD模型及观察其海马形态,观测海马CHAT的变化,探讨VD发病的胆碱能机制及丁苯酞改善脑缺血,提高VD小鼠学习、记忆的胆碱能药理机制。方法:1.采用三次双侧颈总动脉结扎,造成脑组织反复缺血/再灌注,建立了小鼠VD模型,建立假手术组排除手术本身对小鼠的影响,通过跳台试验和水迷宫试验进行学习和记忆成绩测试,观察其行为学改变;用HE染色观察海马病理学特征变化。2.快速断头取脑,4%多聚甲醛溶液固定小鼠脑组织,用免疫组化在光镜下观察各组小鼠海马组织CHAT的表达变化,并且计算其海马CA1区CHAT阳性细胞的面密度值,比较各组海马的表达是否差异。结果:1. VD小鼠模型的行为学评价及海马病理学特征2月龄雄性昆明小鼠56只,随机分为假手术对照组、VD模型组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组。采用双侧颈总动脉结扎,连续三次脑缺血(20 min)再灌注(10min),建立VD小鼠模型。术后29d,各组分别进行跳台试验及水迷宫实验,测试学习成绩;术后30d测试记忆成绩。然后用HE染色观察各组小鼠海马组织病理学特征。1.1学习成绩术后第29天,分别进行跳台试验和水迷宫试验,测试跳台试验反应时间(sec)和错误次数(number/5 min)作为学习成绩,水迷宫试验游完全程时间(sec)和错误次数(number/3 min)作为学习成绩。跳台试验结果显示:⑴与假手术对照组的反应时间(48.76±9.24)s比较,VD模型组小鼠学习阶段的反应时间(89.41±12.08)s明显延长(P<0.01);⑵与VD模型组的反应时间比较,丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的反应时间(59.68±10.27)s及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的的反应时间(57.23±10.05)s均明显缩短(P<0.01);⑶与假手术对照组的错误次数(1.23±0.27)比较,VD模型组小鼠学习阶段的错误次数(3.74±0.42)明显增加(P<0.01);⑷与VD模型组的错误次数比较,丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的错误次数(1.52±0.38)及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的错误次数(1.48±0.31)均明显减少(P<0.01);⑸假手术对照组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组之间的学习成绩无显著性差异(P>0.05)。水迷宫试验结果显示:⑴与假手术对照组的游全程时间(87.32±13.46)s比较,VD模型组小鼠学习阶段的游全程时间(145.80±13.29)s明显延长(P<0.01);⑵与VD模型组的游全程时间比较,丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的游全程时间(101.89±18.38)s及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的游全程时间(99.18±11.25)s明显缩短(P<0.01);⑶与假手术对照组的错误次数(16.88±4.19)比较,模型组小鼠学习阶段的错误次数(34.60±5.92)明显增多(P<0.01);⑷与VD模型组的错误次数比较,丁苯酞治疗组小鼠学习阶段的错误次数(18.71±4.35)及丁苯酞预防治疗组小鼠学习阶段的错误次数(17.29±4.82)明显减少(P<0.01);⑸假手术对照组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组的学习成绩之间无显著性差异(P>0.05)。以上结果提示VD模型小鼠的学习成绩降低,丁苯酞可以改善其学习成绩。1.2记忆成绩术后第30天,分别进行跳台试验和水迷宫试验,测试跳台试验潜伏时间(sec)和错误次数(number/5min)作为记忆成绩,水迷宫试验游完全程时间(sec)和错误次数(number / 3 min)作为记忆成绩。跳台试验结果显示:⑴与假手术对照组的潜伏时间(148.92±20.83)s比较,VD模型组小鼠记忆阶段的潜伏时间(78.67±19.17)s明显缩短(P<0.01);⑵与VD模型组的潜伏时间比较,丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的潜伏时间(131.41±18.82)s及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的的潜伏时间(128.57±18.29)s均明显延长(P<0.01);⑶与假手术对照组的错误次数(0.32±0.05)比较,VD模型组小鼠记忆阶段的错误次数(1.72±0.13)明显增加(P<0.01);⑷与VD模型组的错误次数比较,丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的错误次数(0.54±0.08)及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的的错误次数(0.50±0.07)均明显减少(P<0.01);⑸假手术对照组、丁苯酞预防治疗组、丁苯酞治疗组之间的记忆成绩无显著性差异(P>0.05)。结果提示VD模型小鼠的记忆成绩降低,丁苯酞可以改善其记忆成绩。水迷宫试验结果显示:⑴与假手术对照组的游全程时间(67.82±8.79)比较,VD模型组小鼠记忆阶段的游全程时间(137.40±11.86)明显延长(P<0.01);⑵与VD模型组的游全程时间比较,丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的游全程时间(88.73±9.53)及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的游全程时间(83.87±8.62)明显缩短(P<0.01);⑶与假手术对照组的错误次数(9.57±2.91)比较,模型组小鼠记忆阶段的错误次数(20.90±4.25)明显增多(P<0.01);⑷与VD模型组的错误次数比较,丁苯酞治疗组小鼠记忆阶段的错误次数(11.17±3.04)及丁苯酞预防治疗组小鼠记忆阶段的错误次数(10.27±2.83)明显减少(P<0.01);⑸假手术对照组、丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组的记忆成绩之间无显著性差异(P>0.05)。以上结果提示VD模型小鼠的记忆成绩降低,丁苯酞可以改善其记忆成绩。1.3 VD小鼠海马病理学改变在光镜下,⑴假手术对照组小鼠海马CA1区锥体细胞核大而圆,核仁明显,细胞排列较致密整齐。⑵相比之下,VD模型组小鼠海马CA1区锥体细胞松散,层次不清,有细胞缺失现象;炎性细胞浸润;部分细胞旁有空染区,核固缩、胞质浓染、胞体变小,并且有胶质细胞增生形成结节。⑶丁苯酞治疗组和预防治疗组小鼠海马CA1区锥体细胞排列尚整齐,未发现炎性细胞浸润,核固缩现象较少见。2. VD小鼠海马CA1区CHAT表达水平及丁苯酞的影响2.1 CHAT免疫组化染色小鼠10%水合氯醛麻醉,4%多聚甲醛灌注固定,石蜡包埋,冠状切片,采用SP法行免疫组化染色,观察CHAT阳性神经元数目的变化。结果显示:⑴与假手术对照组海马CA1区CHAT阳性神经元面密度值为:(0.1178±0.0104)比较,VD模型组小鼠海马CA1区CHAT阳性神经元面密度值(0.0823±0.0236)明显减少(P<0.05);⑵与VD模型组比较,丁苯酞治疗组小鼠海马CA1区CHAT阳性神经元面密度值(0.1097±0.0131)和丁苯酞预防组小鼠海马CA1区CHAT阳性神经元面密度值(0.1116±0.0135)明显增多(P<0.05);⑶丁苯酞治疗组、丁苯酞预防治疗组、假手术对照组海马CA1区CHAT阳性神经元面密度之间无明显差异(P>0.05)。此可以提示VD小鼠海马CA1区CHAT水平降低参与了VD的发病机制,丁苯酞和丁苯酞预防治疗组可以防止VD小鼠海马CA1区CHAT水平表达下降而促进其学习和记忆成绩的改善。结论:1.本实验建立的VD小鼠模型可模拟人类VD以学习和记忆能力缺损为主的认知功能障碍,是研究VD比较理想的动物模型,对深入研究VD是可行的。VD模型小鼠海马CA1区出现病理性变化。2. VD小鼠海马CHAT蛋白表达水平降低,与其学习和记忆成绩下降相一致,提示CHAT表达水平降低可能参与了VD的发病。丁苯酞在改善VD小鼠学习和记忆成绩的同时,可显著增加VD小鼠海马细胞内CHAT的表达水平,从而发挥对VD的治疗作用,并且改善了海马组织CA1区病变,此与其学习和记忆成绩改善相一致。提示此药可能具有改善VD的新药理学作用。