乙型肝炎病毒（HBV）基因组X基因编码的x蛋白（HBx）在HBV的复制和扩散中必不可少,其参与调节宿主细胞基因组稳定性、信号转导等过程,但由HBx介导的细胞应激反应与肝脏脂质蓄积和肝脏炎症反应所致肝损伤成为目前研究热点。HBV慢性感染与人群非酒精性脂肪肝炎（NASH）等疾病紧密关联,HBx作为关键调节因子可介导肝细胞脂质蓄积过程,其中细胞器间胆固醇转运功能障碍引起的游离胆固醇（FC）增加与HBx所致脂质蓄积有关。小窝蛋白1（CAV1）大量存在于线粒体与内质网之间偶联的膜结构即线粒体关联性内质网膜（MAM）中,参与胆固醇转运。我们前期研究表明,外源物SPION-NPs可经诱导环氧合酶2（COX-2）至MAM的转位引起肝细胞凋亡增加,并且COX-2可经线粒体脂肪酸β氧化途径在HBx所致肝细胞脂质蓄积发挥重要功能,但其中MAM组分调节胆固醇转运的分子机制是否涉及COX-2对CAV1的调控还有待探讨。蛋白质的转位及活性水平大多存在翻译后修饰如磷酸化修饰的调控,而已有研究表明COX-2存在磷酸化位点,因此猜测,COX-2的转位及活化是否由于其磷酸化修饰状态的改变。哺乳动物体内大量存在的蛋白磷酸酶2A（PP2A）在发挥蛋白质去磷酸化修饰过程中具有重要作用,其中B亚基具有特异性底物识别功能,因此在COX-2的去磷酸化修饰中,PP2A-B亚基引起我们的关注,PP2A-B亚基对COX-2的潜在磷酸化修饰功能及其MAM的转位是我们关注的重点。此外,肝脏具有独特的区域免疫结构和微环境,含有多种免疫细胞亚群和功能分子,其中巨噬细胞经由模式识别受体（PRRs）识别损伤相关分子模式（DAMPs）,调控炎性小体（如NLRP3）的转录、激活进而诱发巨噬细胞极化并引起肝脏区域免疫炎性损伤;由COX-2催化合成的一种DAMPs前列腺素E2（PGE2）在激活NLRP3进而诱导巨噬细胞极化中可能具有重要作用,但其中具体机制仍待阐明。目的:通过建立HBx诱导肝细胞COX-2高表达致脂质蓄积及巨噬细胞炎性活化模型,探明COX-2的表达与MAM转位参与PP2A-B56y调控HBx诱导的COX-2-CAV1相关游离胆固醇（FC）依赖性肝细胞脂质蓄积机制;探讨肝细胞脂质蓄积并伴随DAMPs（本研究关注的PGE2）激活免疫级联效应的肝脏局部免疫调控机制;结果为筛查HBx诱导肝脏脂质蓄积和炎性损伤致NAFLD/NASH的干预靶点提供线索和理论依据。方法:（1）GEO分析:采用GEO数据（GDS4387）,分析HBV相关肝损伤病人及正常对照人群肝脏组织中PP2A-B亚基相关基因的mRNA水平;采用GEO数据库（GSE83148）,分析HBV感染人群及正常对照人群肝脏组织中炎症相关基因（PTGER1-PTGER4,NLRP3,NOS2及CD68）的mRNA水平,及PPP2R5C与上述炎症相关基因的相关性。（2）体外试验:采用HepG2.2.15细胞瞬转HBx单克隆抗体（anti-HBx）表达质粒干预HBx 表达、HepG2 细胞瞬转 pcDNA3.1-HBx（pc3.1-HBx）质粒 6-8h、HepG2-Tet-ON-HBx细胞给予DOX（1 μg/mL）处理48 h诱导HBx表达,以建立HBx表达及干预模型并检测相关指标。①WB检测HBV/HBx作用下COX-2、CAV1的蛋白表达量;免疫荧光（IF）实验通过激光共聚焦显微镜（confocal）观察 pcDNA3.1（pc3.1）或 pcDNA3.1-HBx（pc3.1-HBx）转染下COX-2/CAV1（蓝色荧光点）荧光信号增强,COX-2/CAV1与MitoTracker标记的线粒体（红色荧光点）和ER-Tracker标记的ER（绿色荧光点）共定位分布（形成黄色荧光点以表征MAM）增加,表现为COX-2或CAV1/ER/线粒体的共定位分布（白色荧光点）变化;差速超速离心法提取HepG2-Tet-ON-HBx细胞MAM组分经WB检测COX-2和CAV1蛋白表达量,透射电子显微镜（TEM）观察MAM结构的改变;②qRT-PCR检测HepG2-Tet-ON-HBx细胞总RNA中脂质相关基因的mRNA水平;试剂盒检测TC及FC的含量。③采用HepG2细胞构建稳定高表达CA V1的细胞株HepG2-CA V1,qRT-PCR检测CA V1的mRNA水平,WB检测其蛋白水平,以验证模型的成立,瞬转pc3.1或pc3.1-HBx质粒后,confocal观察FC（以探针Filipin表征）在MAM上的改变及观察脂滴分布（以探针BODIPY 493/503表征）;试剂盒检测TC及FC的含量。④采用实验室前期构建的 HepG2-PTGS2细胞,瞬转 pc3.1 或 pc3.1-HBx 质粒;采用HepG2-Tet-ON-HBx 细胞,进行PTGS2的siRNA（siPTGS2）处理以建立COX-2高表达和基因干预模型,qRT-PCR检测PTGS2的mRNA水平,WB检测COX-2蛋白水平以验证COX-2干预模型的建立;WB检测分别HBx诱导下COX-2高低表达模型中COX-2及CAV1的蛋白水平;confocal观察COX-2及FC在MAM上的改变并观察脂滴分布;试剂盒检测TC及FC的含量。⑤DOX剂量点处理HepG2-Tet-ON-HBx细胞,WB检测PP2A-B亚基蛋白表达量,筛选HBx作用下功能亚基。⑥采用HepG2.2.15细胞瞬转HBx单克隆抗体（anti-HBx）表达质粒干预HBx表达,WB检测PP2A-B56y蛋白水平。⑦采用HepG2-Tet-ON-HBx细胞,邻位连接试验（PLA）观察COX-2与PP2A-B56y之间位置邻近,以及免疫共沉淀（IP）检测蛋白之间相互作用。⑧采用HepG2-Tet-ON-HBx细胞,进行PPP2R5C的siRNA（siPPP2R5C）处理以建立PP2A-B56y基因干预模型,WB检测DOX诱导下PP2A-B56y基因干预模型中COX-2及CAV1的蛋白水平变化;confocal观察COX-2在MAM上的改变;试剂盒检测TC和FC的含量。⑨利用实验室前期采用人肝L02细胞,靶向COX-2 C末端的丝氨酸（S）582,583,584,586或601位点,构建稳定高表达模拟COX-2高磷酸化（D）或低磷酸化（A）的定点突变细胞株,WB检测各突变细胞株COX-2及CAV1蛋白表达量,筛选出COX-2对CAV1调节的功能学位点为COX-2Ser584,进一步采用该细胞株,confocal观察CAV1在MAM上的分布;试剂盒检测TC及FC的含量。⑩采用HBx/HBV表达的肝细胞与人单核细胞来源的巨噬细胞系THP-1细胞,经transwell小室进行共培养,建立肝脏区域免疫暴露模型;肝细胞中siPTGS2处理、巨噬细胞中EP4拮抗剂ONO-AE3-208或NLRP3小分子抑制剂CY-09处理PMA引发的THP-1细胞作为干预组。WB检测肝细胞中COX-2蛋白水平;ELISA试剂盒检测共培养系统中肝细胞层PGE2和巨噬细胞层IL-1β释放水平;qRT-PCR检测PGE2受体家族（EP1-EP4）基因（PTGER1-PTGER4）mRNA水平,WB检测细胞以及胞浆和胞核组分中NLRP3炎症小体、炎性相关分子、iNOS、CD206蛋白水平。（3）体内试验:采用8-10周龄HBx转基因C57BL/6小鼠（HBx-Tg小鼠）以野生型（WT）C57BL/6小鼠为对照,建立HBx暴露模型,采用COX-2的选择性干预剂塞来昔布（CELE,30 mg/kg）建立干预模型;采用蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCD）饮食诱导NAFLD/NASH的阳性模型。①WB实验检测肝脏组织中HBx,PP2A-B56y,COX-2和CAV1,NLRP3炎性相关因子（NLRP3,ASC,IL-1β）的蛋白水平②透射电子显微镜（TEM）观察MAM结构改变和脂滴水平。采用小鼠血清样本和肝脏组织样本等进行①检测血清和肝组织匀浆中AST和ALT等肝功能指标;②试剂盒检测TC和TG含量;③试剂盒检测FC含量;④酶联免疫吸附实验（ELISA）检测炎性因子PGE2和IL-1β的释放水平。采用小鼠肝组织切片进行①油红O染色观察冰冻切片脂滴水平变化;②免疫组织化学实验（IHC）检测观察肝组织中各分子变化;③天狼星红实验观察胶原沉积;④苏木素-伊红（HE）染色切片观察肝组织炎性灶。结果:（1）GEO分析:经数据库分析,分别与健康对照组相比,HBV相关肝损伤患者中PP2A-B亚基中PPP2R5C的mRNA水平显著升高;HBV感染者中,各炎症相关基因（PTGER1-PTGER4,NLRP3,NOS2,CD68）mRNA 水平显著升高,且均与 PPP2R5C呈显著正相关。（2）体外试验:①与对照HepG2细胞比较,携带HBV基因组的HepG2.2.15细胞中HBx表达,给予anti-HBx质粒转染,可明显抑制细胞内HBx表达,相应地,与对照组HepG2细胞相比,HepG2.2.15细胞中COX-2蛋白水平增高,CAV1蛋白水平降低,而采用anti-HBx处理组细胞中COX-2蛋白水平降低,CAV1蛋白水平增高;与对照组相比,DOX处理的HepG2-Tet-ON-HBx细胞中COX-2蛋白水平增高,CAV1降低,MAM组分中COX-2增加,CAV1减少,细胞MAM区域间距显著增加,约为对照组细胞的3倍（P＜0.05）;与pc3.1对照质粒转染组相比,pc3.1-HBx质粒转染组HepG2细胞中COX-2（蓝色荧光点）荧光信号增强,表现为COX-2/ER/线粒体的共定位分布（白色荧光点）增高;同时也可观察到CAV1荧光信号减弱,以及与MAM的共定位分布降低。②与对照组相比,DOX处理组参与细胞内脂质代谢的基因（SREBP1,PPARG,PPARA,CPT1A）中,CA V1 mRNA水平显著下调（P＜0.05）,TC及FC的含量明显升高（P＜0.05）。③与pc3.1-HBx转染的HepG2-pB组相比,pc3.1-HBx转染的HepG2-CA V1细胞中FC在MAM上的分布减少,LD的数量明显减少（P＜0.05）,TC和FC水平显著减低（P＜0.05）。④在COX-2高低表达模型中,与对照组相比,COX-2高表达时CAV1蛋白水平的降低,以及在COX-2敲低表达时CAV1蛋白水平升高;COX-2高表达时FC在MAM的分布增加以及LD分布增加,而在COX-2低表达时FC在MAM的分布又有所降低以及LD分布减少;COX-2高表达时TC及FC含量的增加,而低表达COX-2时TC及FC含量的减少。⑤与对照组相比,PP2A-B56γ的蛋白水平随DOX处理呈明显的剂量依赖性增加。⑥与对照HepG2细胞比较,携带HBV基因组的HepG2.2.15细胞中PP2A-B56y蛋白水平增高,且随anti-HBx的处理而降低。⑦与对照组相比,DOX处理组COX-2与PP2A-B56y之间位置邻近效应明显（P＜0.05）,COX-2与PP2A-B56γ蛋白之间相互作用增强。⑧与对照组相比,siPPP2R5C联合DOX处理组COX-2蛋白水平增加,CAV1蛋白水平降低,COX-2在MAM的分布减少,TC和FC的含量减低。⑨与L02-pBabe及其他高低磷酸化位点突变细胞株相比,L02-COX-2S584A细胞（低磷酸化）中CAV1蛋白水平减低,L02-COX-2S584D（高磷酸化）中CAV1升高;并且,与L02-COX-2S584D细胞相比,L02-COX-2S584A细胞中CAV1在MAM的分布、LD的数量、TC和FC水平均明显增加。⑩与对照组细胞相比,单层培养的HBx/HBV表达肝细胞中PGE2释放增加;模拟肝脏区域免疫的HepG2-THP1共培养模型下,与对照处理肝细胞-THP-1共培养相比,DOX处理肝细胞-THP-1共培养中PGE2、IL-1β增加,NF-κB p65在胞浆中降低和胞核中增高,与该模型下NLRP3及其活化相关分子（ASC、p10、IL-1β）和iNOS蛋白水平增加,CD206降低相比,经EP4拮抗剂ONO-AE3-208或NLRP3小分子抑制剂CY-09处理PMA引发的THP-1后,NLRP3及其活化相关分子（ASC、p10、IL-1β）和iNOS蛋白水平减低、CD206增加。（3）体内试验:与WT小鼠小鼠相比,HBx-Tg小鼠肝组织:①脂滴含量增加;②TC、TG和FC含量增加;TEM观察到MAM距离增加和脂滴增多;③炎性灶数量增加;④胶原沉积增加;⑤COX-2、NLRP3炎症小体和M1极化相关蛋白升高;⑥COX-2、PP2A-B56γ的阳性染色增多,CAV1阳性染色减少;⑦PGE2和IL-1β分泌增加。与HBx-Tg小鼠组相比,CELE干预联合HBx-Tg组小鼠中上述指标得到挽救;与MCD饮食的WT小鼠组相比,MCD饮食的HBx-Tg组除上述指标增加外,肝脏组织切片可见组织的空泡化更加严重。结论:本研究阐明了 HBx通过促进COX-2表达增加及MAM的转位引起胆固醇代谢紊乱及脂质蓄积,同时通常COX-2的表达催化合成PGE2介导细胞间通讯,引发肝脏局部免疫依赖性肝脏炎性损伤,为探讨HBx肝毒性所致NAFLD的调控机制与干预靶标提供理论依据。