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研究背景及目的器官移植是治疗多种终末期疾病的唯一有效手段,但急性移植排斥反应(acute rejection,AR)依然多发。AR是导致移植器官损害以致失活的重要原因,严重影响患者预后。急性移植排斥反应的早期特异性无创性诊断技术对保护移植器官,延长移植器官存活期有重要意义。大量研究表明,外周血及尿中趋化因子配体10 (CXCL10, C-X-C motif chemokine 10)在器官移植前及器官移植后的变化对移植器官预后有一定预测意义。CXCL10与其受体趋化因子受体3(CXCR3, C-X-C motif receptor 3)共同介导包括Thl细胞在内的多种CXCR3阳性免疫细胞到急性排斥部位的募集,并且在AR发生免疫细胞募集的早期阶段即开始发挥重要作用,其在移植器官局部的表达量与AR发生密切相关。在促炎微环境下CXCL10能够被中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,单核细胞,内皮细胞,上皮细胞,基质细胞和角质细胞等多种细胞分泌,并且表达上调早于CXCR3的另一配体CXCL9,因此检测局部CXCL10的表达量能够比检测CXCL9更早地诊断CXCR3阳性免疫细胞的浸润。分子影像学技术快速发展使在活体状态下无创性实时监测某一靶分子的分布及相对量成为可能。本论文在确定CXCL10是一与AR起始密切相关的靶点的基础上,成功制备了CXCL10靶向特异的131Ⅰ-anti-CXCL10 mAb分子探针,并对CXCL10的分布进行放射性显像,探讨其在AR早期诊断中的应用价值。由于131Ⅰ-anti-CXCL10 mAb分子量大,其体内分布及排除较缓慢,药物代谢动力学不够理想,因此本课题第二部分探讨了以小分子125Ⅰ-CXCL10(8.5 Kd)为探针,以其受体CXCR3为靶点,实时监测AR的可行性。第一部分：以CXCL10为靶点的早期急性移植排斥显像研究研究方法1.建立同种皮肤移植小鼠模型：以C57BL/6小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体建立同种皮肤移植模型,同时以BALB/c小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体建立同系皮肤移植模型。逐日观察移植物生存状况。1mg/kg.d他克莫司腹腔给药的药物处理同种移植模型建立同种移植免疫抑制模型。移植后第10天用HE染色验证各组皮片处排斥状况。2.CXCL10 mRNA及蛋白的检测：于移植后第10天分别取移植部位皮片及对侧正常皮片进行RT-PCR检测CXCL10 mRNA的相对表达。同时利用免疫组织化学分析法及ELISA法测定移植后第10天移植皮片、血液和脾中CXCL10蛋白表达状况。3.放射性碘化标记：Iodogen法131I标记anti-CXCL10mAb,纸层析法检测放射性化学纯度及稳定性。4.体内生物学分布研究：小鼠皮肤移植后第8天尾静脉注射131I-anti-CXCL10 mAb后不同时间处死小鼠,取移植皮片及主要器官,称重,测量放射性,研究观察131I-anti-CXCL10的体内生物分布状况及靶向性。5.放射性磷屏显像研究：小鼠皮肤移植后第8天尾静脉注射131I-anti-CXCL10mAb后不同时间麻醉小鼠后,进行放射性磷屏131I-anti-CXCL10的体内生物分布显像。大剂量未标记的anti-CXCL10 mAb尾静脉预先注射进行阻断实验,验证131I-anti-CXCL10靶向特异性。研究结果1.成功制备同种及同系移植模型；移植后第10天时同种移植组皮片处可见大量淋巴细胞浸润,排斥反应明显；他克莫司药物处理组淋巴细胞浸润较未用药组显著减少,排斥反应较轻；同系移植组未见明显淋巴细胞浸润,无明显排斥反应。2.RT-PCR, ELISA以及免疫组化结果均显示：与同系对照组及他克莫司处理的同种移植组相比,未处理同种移植组移植皮片CXCL10表达最高,他克莫司处理能显著抑制同种移植皮片及脾的CXCL10表达,降低血中CXCL10水平。3.成功制备了131I-anti-CXCL10mAb,其放射化学纯度较高(98%),稳定性较好,制备后72h放射化学纯度仍高于95%。4.体内生物分布数据同时显示药物经肝脏代谢、肾脏排泄。同种移植皮片处放射性浓聚最高,与显像结果相一致。同种移植组在给药后72 h时的靶/非靶比值为4.15±0.25,明显较他克莫司处理组靶/非靶比值(2.29±0.10)高。5.磷屏放射自显影显示,同种移植皮片在注射显像剂后的6h至72 h的各检测时间点均清晰显像,而他克莫司处理组放射性浓聚不明显,同系对照组未发现放射性浓聚。尾静脉预先注射大剂量未标记CXCL10 mAb可显著减低同种移植皮片对131I-anti-CXCL10mAb的摄取。研究结论：1.CXCL10可以作为早期急性移植排斥的分子显像诊断靶点,需进一步研究。2.131I-anti-CXCL10 mAb能够成功地进行以CXCL10为靶点的急性排斥反应显像,并且能够检测免疫抑制药物的作用。第二部分：小分子显像剂125I-CXCL10监测早期急性移植排斥的研究研究方法1.建立皮肤移植小鼠模型并检测CXCR3表达：制备以BALB/c小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体的同系皮肤移植模型,以C57BL/6小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体的同种皮肤移植模型。取移植后第9天小鼠进行RT-PCR及免疫组化法验证移植皮片处CXCR3表达。2.放射性碘化标记：四氯二苯基苷脲(Iodogen)法125I标记CXCL10,纸层析法检测放射性化学纯度及稳定性。3.结合特异性验证：取同种移植第8天的小鼠脾细胞进行125I-CXCL10与CXCR3阳性脾细胞的受体放射性配基结合实验。4.药物代谢动力学实验：取同种移植第8天小鼠尾静脉注射125I-CXCL10后进行药物代谢动力学实验。5.体内生物分布：小鼠皮肤移植后第8天尾静脉注射125I-CXCL10后观察CXCR3阳性细胞的体内生物分布。6.皮肤移植小鼠磷屏自显影显像。研究结果1.CXCR3表达状况：RT-PCR及免疫组化染色结果均显示：与同系对照组相比,同种移植组移植皮片CXCR3表达量明显较高；同系组CXCR3表达量与对侧正常皮片处无显著差异。2.成功制备了125I-CXCL10,放化纯为98%,稳定性好,72h时仍高于95%。3.受体放射性配基结合实验结果表明125I-CXCL10可与细胞特异性结合,平衡解离常数KD值为3.48±0.31 nM,其免疫活性约为90%。4.药物代谢动力学分析表明,125I-CXCL10具有较好的药物代谢动力学特性,符合二室分布模型,其分布相半衰期为0.34 h,消除相半衰期为9.83 h。5.24 h时的体内生物分布研究结果显示实验组同种移植皮片放射性浓集明显,靶/非靶比值为3.01±0.25；同系对照组移植皮片无明显放射性浓集,靶/非靶比值为1.14±0.10,与正常对侧皮肤无显著差异。6.全身磷屏显像结果显示,注射125I-CXCL10显像剂3h时,同种移植皮片即可清晰显像,随显像剂的排出本底降低12h时对比更显著,24 h时皮片处放射性浓集仍较高。而同系对照组移植皮片处在24 h内均未见明显放射性浓集。研究结论CXCR3是急性移植排斥反应早期炎症细胞浸润的良好核素显像靶点,125I-CXCL10具有良好的药物代谢动力学特性,可以较好显像急性移植排斥反应。