禾谷镰孢茵（Fusarium graminearum）侵染小麦、大麦、水稻等多种禾谷类作物,造成穗腐病、赤霉病等多种植物病害,同时也是引起大豆根腐病的主要病原物之一。使用化学农药和培育抗病品种是目前农业生产中防控作物病害的主要防治措施。然而,对化学农药的长期不合理使用导致了植物病原菌抗药性的产生,并且药剂的残留也威胁着生态环境和农产品安全:同时,植物病原菌的快速变异也会导致单一抗病品种易被病原菌克服。因此,发展绿色安全的新型生物农药是目前农业高质高效、可持续发展的需要。植物病原菌会通过分泌大量的效应子操控寄主植物的免疫反应,而植物则能够通过识别病原菌的效应子激活自身的免疫。鉴定能够诱导植物免疫的病原菌胞外效应子,并以其为探针揭示植物免疫的作用机制,对新型植物免疫诱抗剂的创制有着重要意义。本研究旨在寻找禾谷镰孢菌分泌的植物免疫诱抗蛋白,通过对禾谷镰孢菌培养滤液中可能含有的具有诱导植物免疫活性的蛋白质进行分析鉴定,发现了6个潜在的能诱导植物免疫的效应子,并从中选择了 Fg5和Fg12,对其诱导植物免疫活性功能进行了进一步的研究。具体研究内容如下:一、禾谷镰孢菌诱导植物免疫相关蛋白的筛选鉴定。研究发现禾谷镰孢菌培养滤液能够引起烟草叶片细胞死亡,将培养滤液煮沸后则发现其丧失了诱导细胞死亡的能力。推测其中含有一些具有诱导植物免疫活性的蛋白类物质。随后收集禾谷镰孢菌培养滤液,进行质谱分析,寻找潜在的可能具有诱导植物免疫活性的蛋白。根据质谱结果共鉴定了 72个候选基因并克隆到了其中61个。利用烟草瞬时表达系统,最终筛选得到6个能够诱导植物细胞死亡的禾谷镰孢菌效应子,推测其可能具有诱导植物免疫的活性。二、Fg5的功能及诱导植物免疫活性分析。对先前筛选得到的候选效应子Fg5进行功能分析。生物信息学分析发现Fg5是GH12家族成员,在微生物中广泛存在。Fg5具有糖基水解酶结构域,进一步研究证明了 Fg5具有木葡聚糖水解酶活性,能够降解其底物木葡聚糖。在烟草中瞬时表达Fg5,发现其能够诱导强烈的细胞死亡,且其诱导细胞死亡的能力依赖于N端信号肽而不依赖其水解酶活性。通过大肠杆菌原核表达获得Fg5纯蛋白并用其处理烟草发现,Fg5及其酶活突变体能够诱导烟草叶片的细胞死亡,同时也能够引起多个植物防卫相关基因的上调表达。此外,用Fg5的纯蛋白处理烟草叶片并接种烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）发现其能增强烟草对TMV的抗性。同样用Fg5处理大豆黄化苗下胚轴并分别接种禾谷镰孢菌、大豆疫霉和终极腐霉,发现Fg5纯蛋白能够诱导大豆对不同病原菌的抗性。这表明Fg5具有诱导植物免疫的功能。三、Fg12的功能及诱导植物免疫活性分析。生物信息学分析发现Fg12是一类外泌型核糖核酸酶,在不同真菌中广泛存在,且不同真菌中Fg12的同源物均能诱导烟草细胞死亡。Fg12具有降解大豆总RNA的活性,且其诱导烟草细胞死亡能力依赖于RNA酶活性、信号肽以及光照。通过大肠杆菌原核表达获得Fg12纯蛋白,实验发现仅高浓度条件下的Fg12纯蛋白其能够诱导烟草细胞死亡,且Fg12纯蛋白诱导的烟草防卫相关基因上调表达水平较低。在烟草上沉默植物基础免疫通路的关键基因BAK1和SOBIR1,发现Fg12诱导细胞死亡不依赖BAK1和SOBIR1。体外诱导植物抗病性实验发现,Fg12能诱导大豆对禾谷镰孢菌的抗病性。综上所述,我们的结果表明RNase效应子Fg12具有诱导植物免疫的活性。