研究背景和目的:肺癌是全世界最常见而且研究报道其死亡率也是最高的恶性肿瘤,在全球许多的国家包括我国肺癌的死亡率已经遥遥高于其他的恶性肿瘤,已位居全部恶性肿瘤死因的首位。许多的研究已经发现基因的单核苷酸多态性决定着个体遗传变异,是目前应用最为重要的的遗传标记物之一。Micro RNA(mi RNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA,mi RNA通常情况下主要以高度保守的方式参与其下游基因表达的调控。研究已经证实mi RNA的单核苷酸多态性可能发生在mi RNA从开始翻译到成熟的过程中的任一环节。单核苷酸基因多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)已经成为了检查遗传信息改变的重要标志之一,已经慢慢成为了人类基因组计划走向应用的关键的步骤,而且越来越多的研究发现其可以参与影响到疾病易感性、个体药物反应的敏感性。大量的研究证实micro RNA在许多的恶性肿瘤中存在明显的异常表达,其中mi RNA在肺癌中明显异常表达,而且与肺癌的恶性程度、耐药性均密切相关。有研究发现mi R-146a在肿瘤中表达明显低于其对应的癌旁组织。有意思的是,最近大量研究发现mi R-146a与非小细胞性肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)的发生发展密切相关,但具体作用机制未知。此外,有大量的研究发现MIF在黑色素瘤、NSCLC、肝癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌等多种癌组织中高表达。MIF参与了肺癌特别是NSCLC的发生和发展,Kamimura等通过免疫组化检查发现NSCLC患者的肺组织MIF过度表达,且研究证实MIF的表达情况与预后存在相关性。大量的研究报道MIF在许多的良性病变的正常的肺组织、NSCLC组织、淋巴结转移灶的组织中的表达呈现逐渐增强,且研究也证实高表达MIF的总体生存率低于低表达的。提示NSCLC中mi R-146a及MIF都存在异常表达。本课题在此基础上,通过RT-PCR法及免疫组化分别检测mi R-146a,MIF在NSCLC肺组织中的表达,并通过通过荧光素酶报告基因分析验证MIF是否是mi R-146a的下游靶基因,进一步用转染mi R-146a模拟物改变细胞内的mi R-146a的表达,从而观察NSCLC细胞的生物学特,并探讨其对NSCLC细胞中MIF的表达与细胞增殖情况的影响及具体作用机制。方法:1、对支气管肺癌患者及良性病变患者手术切除的石蜡标本进行DNA提取并PCR检测,分析良恶性病变mi R-146a单核苷酸多态性的差异及其与良恶性病变临床特征之间的相关性,分析基因多态性在支气管肺癌患者人群中的表达情况。2、RT-PCR法检测mi R-146a在NSCLC组织和癌旁正常肺组织及四株NSCLC细胞株和正常人胚肺细胞中的表达,免疫组化检测MIF在NSCLC组织和癌旁正常肺组织中的表达。3、通过荧光素酶报告基因等实验方法探讨MIF是否是mi R-146a的特异性的下游靶基因,并将构建的mi R-146a模拟物和mi R-146a阴性对照(NC)组通过基因转染至NSCLC细胞中,改变mi R-146a的表达情况,从而通过q PCR和Western blotting检测MIF的m RNA及蛋白的表达情况的变化。此外,我们进一步通过运用了MTT法检测改变mi R-146a后细胞活力、平板克隆实验检等检测肿瘤细胞增殖能力,同时也运用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡,也观察了天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase 3)的活性的改变情况,同时通过Western blotting分析改变mi R-146a后肺癌细胞中NF-κB-p65蛋白的表达的变化。结果:1、本研究发现mi R-146a基因在肺癌患者中检出率低于对照组,且其单核苷酸基因多态性与肺癌有相关性。2、NSCLC细胞中的mi R-146a低于正常胚肺组织。通过脂质体将mi R-146a模拟物转染到A549细胞后,与NC组比较,MIF蛋白及m RNA表达量都显著下降(p<0.01),细胞活力下降(p<0.01),克隆数目减少(p<0.01),细胞凋亡数目增加(p<0.01)。3、NSCLC肺组织中的mi R-146a表达量低于癌旁正常肺组织。MIF蛋白在NSCLC肺组织中的表达高于癌旁正常肺组织,且荧光素酶报告基因证实MIF是mi R-146a下游靶基因,mi R-146模拟物转染到A549细胞后,Caspase 3活性升高(p<0.01),NF-κB p65磷酸化水平下调(p<0.01)。结论:在肺癌患者中mi R-146a单核苷酸基因多态性与肺癌有相关性,mi R-146a在NSCLC组织及细胞株中低表达,MIF在NSCLC组织中过表达,mi R-146a表达上调可通过靶向抑制MIF表达,从而抑制A549肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,可能是通过NF-κB信号通路实现的。