本文以途径工程理论和代谢控制发酵原理为指导,研究了利用Red重组技术构建dapA基因缺失菌株及其发酵条件的优化。主要研究内容和结果如下:1.采用PCR技术,扩增合成了两端为dapA基因同源序列(各50 nt),中间为两端带有FRT位点的卡那霉素筛选基因片段。将所得线性化重组片段,经电转化,转入E.coli K12/pKD46感受态细胞中。在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上对应区域发生重组,将基因dapA置换,构建dapA基因缺失突变株。经过基因组PCR鉴定,重组片段成功与目的基因发生同源置换,获得具有卡那霉素抗性的dapA基因缺失株K12△dapA::Kan。最后,在FLP重组酶的作用下将FRT位点间的卡那霉素抗性基因去除,达到无痕敲除的目的。对重组菌株进行营养缺陷型筛选,成功得到一株赖氨酸缺陷型菌株,命名为K12△dapA。2.在相同培养条件下,测定原始菌株Escherichia coli K12和重组菌株K12△dapA发酵液上清中L-苏氨酸的含量。在未经发酵条件优化下发酵72 h,K12△dapA积累L-苏氨酸3.7 g/L,是Escherichia coli K12原始菌株的3倍。3.研究了菌株K12△dapA的摇瓶分批发酵条件。采用正交设计、均匀设计等实验设计方法,应用SPSS数据处理系统和均匀设计试验设计和分析系统(MDAS)获得了该菌株种子培养基与发酵培养基优化配比,并对种子培养条件与发酵条件进行了研究。在优化条件下,菌株E.coli K12△dapA摇瓶分批发酵72 h,产L-苏氨酸达8.2 g/L。