论文部分内容阅读
目的:观察去势大鼠经低剂量唑来膦酸(Zoledronic acid,ZOL)作用后,其对下颌骨骨吸收的影响,进一步探讨细胞核转录因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号系统在ZOL抑制破骨细胞形成过程中的调控效应与机制。方法:取72只雌性SD大鼠随机分为三组(n=24/组):假手术对照组(Sham)、去卵巢模型组(OVX)和去卵巢唑来膦酸治疗组(ZOL-20),后两组大鼠行两侧卵巢切除术,建立骨质疏松模型,假手术对照组去除同等质量卵巢周围的脂肪。去卵巢3个月后,治疗组皮下一次性注射ZOL20μg/kg,Sham组和OVX组皮下注射相同剂量的生理盐水,同时在麻醉下拔除所有大鼠左侧下颌磨牙,拔牙后分别在4周、12周处死一半(n=12/组)动物取出拔牙侧下颌骨组织进行相关检测。通过影像学X射线大致观察大鼠拔牙窝剩余牙槽骨状况;苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)和马松三色原染色(Masson trichrome staining,Masson)检测下颌牙槽骨病理结构改变;应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick labeling,TUNEL)检测成骨细胞凋亡的数目变化;酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清骨吸收指标I型胶原羧基端肽(Cross-linked C-terminal telopeptide of type I collagen,CTX-I)和骨形成指标I型前胶原氨基端肽(Procollagen type I N-terminal propeptide,PINP)的变化;实时定量荧光PCR(Real-Time quantitative PCR,RTq PCR)检测破骨细胞形成相关基因的表达水平:NF-κB、细胞核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear kappa-B,RANK)、活化T细胞核因子(Nuclear Factor of Activated T cells c1,NFATc1);利用免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)检测下颌牙槽骨内的蛋白RANKL、NF-κB表达情况;采用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测破骨细胞相关蛋白(RANKL、IκBα与p-IκBα、NF-κBp65与p-p65)的表达水平。结果:1.影像学:所有分组的拔牙窝处牙槽骨均有密度减低影,但与OVX组相比较,ZOL治疗组的牙槽窝骨密度影在4周和12周均较高。2.病理组织学:HE染色显示:术后4周各组骨质与12周相比较为疏松,ZOL治疗组与OVX组相比较成骨活跃,骨小梁排列紧密,结构较为完整;Masson染色显示:4周时各组主要是以淡蓝色为主的不成熟的编织骨为主,12周各组主要是以淡红色为主的成熟骨组织组成;与OVX组相比ZOL治疗组的胶原纤维明显减少(P<0.05)。3.TUNEL凋亡实验检测发现:术后12周各组与4周相比,下颌骨成骨细胞的凋亡数目均有不同程度的减少;与OVX组相比ZOL治疗组的成骨细胞凋亡数目明显减少(P<0.05)。4.ELISA血清学检测发现:OVX组的CTX-I和PINP蛋白的表达水平均较高,经ZOL作用后,骨吸收指标CTX-I和骨形成指标PINP两者均有降低(P<0.05)。5.RT-PCR结果显示:与OVX组相比较,ZOL治疗组的NF-κB、RANK、NFATc1基因表达水平在4周、12周均有不同程度下降,其中RANK和NFATc1较为显著(P<0.05)。6.免疫组化结果显示:与OVX组相比较,RANKL、NF-κB蛋白经ZOL作用后表达量均降低(P<0.05);RANKL蛋白表达在4周和12周无明显差异,OVX组的NF-κB蛋白表达水平在12周偏低(P<0.05)。7.Western blot结果显示:与OVX组相比较,4周、12周的RANKL、p-IκBα、p-p65蛋白经ZOL作用后其表达量均显著下降(P<0.05),总蛋白IκBα和p65蛋白在各组表达无明显差异。结论:低剂量ZOL对下颌骨骨吸收有一定抑制作用,而NF-κB信号通路可能参与抑制破骨细胞分化与成熟的作用,同时ZOL调控成骨细胞的凋亡。