论文部分内容阅读
大口黑鲈是目前我国淡水养殖的主要品种,随着大口黑鲈养殖业的快速发展,针对大口黑鲈精准营养需求的专用配合饲料研发的重要性日益凸显。叶酸作为水产动物维持生长且不可或缺的B族水溶性维生素之一,以辅酶四氢叶酸参与体内物质代谢,作为一碳单位的供体参与氨基酸代谢并提供甲基用于甲基化。为了探究大口黑鲈幼鱼实用饲料中的叶酸最适需求量及其作用机制,基于传统养殖实验,通过对不同水平的叶酸对于大口黑鲈幼鱼生长性能,机体组成,血液学指标,营养代谢,抗氧化免疫等方面的效应分析,结合生长性能与添加梯度的回归分析剂量效应关系,确定大口黑鲈对饲料中叶酸的最适需求量,最后通过转录和翻译层面的组学分析,初步探究大口黑鲈幼鱼对于饲料叶酸的响应及其作用机制。1.不同叶酸添加水平对于大口黑鲈幼鱼生长性能、血液生化、抗氧化能力和免疫的影响为了评估饲料中叶酸对于大口黑鲈的作用效果,确定大口黑鲈幼鱼实用饲料中叶酸的最佳需求量,基于基础实用饲料配制了叶酸添加量分别为0mg/kg（FA0）,0.5mg/kg（FA0.5）,1.5mg/kg（FA1.5）,4.5mg/kg（FA4.5）,13.5mg/kg（FA13.5）的实验饲料（基础实用饲料中测得的叶酸值＜0.18 mg/kg）,饲养初始体重为14.49±0.06 g的幼鱼7周。结果表明,各叶酸添加组鱼体的增重率（WGR）和特定生长率（SGR）均不同程度地高于对照组,且叶酸添加量为1.5mg/kg时增重率和特点生长率达到最大值,显著性高于无叶酸组（P＞0.05）;随着饲料中叶酸添加水平的升高,脏体比（VSI）、肝体比和肠体比显著性降低（P＞0.05）。在饲料中添加≥0.5mg/kg的叶酸,可显著性提高全鱼粗蛋白含量（P＞0.05）。添加0.5-1.5 mg/kg叶酸组,全血细胞的血红蛋白含量和血细胞比容显著性增加（P＞0.05）,添加0.5 mg/kg叶酸后,红细胞的数量也显著性增加。血浆总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）含量随着饲料叶酸水平的升高先上升后下降,在1.5mg/kg时达到最大值,并与无叶酸组有显著性差异（P＞0.05）。添加0.5mg/kg及以上的叶酸后,血浆谷丙转氨酶（GPT）活性显著性下降（P＞0.05）,肝脏GPT活性提高,添加0.5mg/kg及以上的叶酸后,血清丙二醛活性显著性下降（P＞0.05）,添加0.5mg/kg的叶酸可显著性提高肝脏总抗氧化能力（P＞0.05）,添加1.5mg/kg的叶酸显著提高肝脏过氧化氢酶和头肾溶菌酶活性（P＞0.05）。添加0.5mg/kg及以上的叶酸可显著降低肝糖原含量（P＞0.05）。基于生长性能的回归分析表明,大口黑鲈幼鱼饲料中叶酸的最适添加量为1.42-1.46 mg/kg。2.叶酸影响大口黑鲈消化能力、肠道抗氧化能力和肌肉品质的研究为了探究饲料叶酸对于大口黑鲈消化能力、肠道抗氧化能力以及肌肉品质的影响,就第一章的实验鱼进一步检测相关指标。结果显示,添加13.5mg/kg叶酸胃蛋白酶显著高于无叶酸组（P＜0.05）,FA0.5组和FA13.5组胃脂肪酶显著高于FA0组（P＜0.05）;添加叶酸各实验组幽门盲囊胃蛋白酶均显著性高于无叶酸组（P＜0.05）,幽门盲囊脂肪酶随着叶酸的添加先上升后下降且在4.5mg/kg添加组达到最大值（P＜0.05）;各消化部位淀粉酶活性均随着叶酸的添加而有所下降。中肠钠钾ATP酶活性随着叶酸的添加先上升后下降,且在FA1.5组达到最大值（P＜0.05）。随着叶酸的添加,总抗氧化能力呈现先上升后下降的趋势,且在FA4.5组达到最大值（P＜0.05）,过氧化氢酶各组之间无显著性差异（P＞0.05）。添加1.5mg/kg以上叶酸各组组氨酸,赖氨酸和总必需氨基酸含量显著性高于无叶酸组（P＜0.05）。添加13.5mg/kg叶酸显著性降低总饱和脂肪酸含量（P＜0.05）,FA1.5组单不饱和脂肪酸总含量与多不饱和脂肪酸总含量显著性高于其他各组（P＜0.05）,其中各个脂肪酸含量均呈现相一致的结果。研究表明饲料中添加叶酸可提高大口黑鲈对于饲料中蛋白质与脂肪的利用能力,添加4.5mg/kg的叶酸可以使得肠道抗氧化能力达到最大值,添加4.5mg/kg的叶酸可使得大口黑鲈肌肉氨基酸和脂肪酸组成达到最优。3.大口黑鲈幼鱼响应饲料叶酸的肝脏转录机制分析为探究饲料中叶酸对于大口黑鲈生长,生理调控机制。因而本章实验根据第一章的生长性能结果,选取无叶酸组（FA0）和最佳生长组（FA1.5）的肝脏从转录水平上进行研究。转录组学结果显示:以FA0为对照组,FA1.5为实验组,共检测到的差异Unigene数量为638（P＜0.05）,其中266个上调Unigene,372个下调Unigene。通过GO富集分析结果显示一共得到627条富集条目,共筛选出437条显著性富集条目（P-adj＜0.05）,富集到差异基因最多的与细胞组分有关,富集到的显著性差异条目如免疫应答、DNA合成、抗原加工和呈递等条目。通过KEGG显著性富集通路筛选后（P-adj＜0.05）,结果发现共显著性富集到6条通路,主要富集在消化系统,内分泌系统,翻译和心血管疾病,其中富集到最多差异基因的是蛋白质消化吸收通路。选取7个差异表达基因进行验证,RT-PCR验证结果与差异基因转录组测序获得的FPKM值变化趋势一致。上述结果初步阐明了饲料中添加叶酸条件下大口黑鲈肝脏组织基因所参与的生物过程、代谢途径或信号通路等,而叶酸可以有效改善蛋白质的合成并增加在肌肉中的沉积,可能与叶酸激活PI3K-Akt和MAPK信号通路,激活下游效应因子有关。4.大口黑鲈幼鱼响应饲料叶酸的肝脏蛋白组学及其与转录组的联合分析为进一步探究饲料中叶酸对于大口黑鲈的调控机制,实验组选取同第三章,从翻译水平上进行研究。蛋白质组学结果显示:以FA0为对照组,FA1.5为实验组,共检测到183个显著性差异表达蛋白（P＜0.05）,有31个差异表达蛋白显著性上调,152个差异表达蛋白显著性下调。根据GO功能注释结果显示,有37987个蛋白注释到GO库,其中注释到GO库的总差异蛋白有151个,前30条条目中富集到条目最多的是生物学过程,有17条显著性富集,其次是分子功能,有9条,最后是细胞组分,富集到基因数目最多的是细胞外区域,其次是细胞黏附。差异蛋白富集到的条目分别为紫外保护,胶原蛋白代谢过程调节,弹性纤维组成,细胞对紫外线B的反应,超分子纤维组织,结构分子活性。根据KEGG注释结果显示,共有15404个蛋白注释到其中,差异蛋白有54个注释到该库,一共富集到的通路有104条,其中25条上调,91条下调,相比于对照组,实验组富集到脂代谢通路上的2个差异蛋白都显著性上调,13条通路上富集的差异蛋白都显著性下调,主要分为代谢和有机系统。通过差异基因和差异蛋白的序列比对,只比对到一组相似性较高的基因和蛋白,但该差异基因和差异蛋白表达趋势相反,富集到的GO条目有3条,分别是丝氨酸类内肽酶活性,细胞外区域和金属离子结合,富集到KEGG的代谢通路只有两条,整合后富集到一条通路为胰腺分泌相关通路。叶酸可能影响胰腺分泌中的CELA表达从而调控蛋白质消化吸收通路。