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世界范围内,结肠癌发病率和死亡率均位居前列,我国近年来发病率呈持续上升趋势,位居恶性肿瘤前十。结肠癌早期可以没有任何症状,而出现腹胀、消化不良及排便性状或习惯改变往往已进展到中晚期,因此大大增加大了其治疗难度。治疗仍以外科手术及术后辅助化疗为主。在生存期方面,临床IV期患者的生存率略大于10%。近年来,免疫治疗技术的突飞猛进为肿瘤治疗带来希望和曙光,本研究即希望使用细胞免疫疗法提高结肠癌的治疗效果。近年来,分子免疫学研究逐步揭示了肿瘤免疫微环境中调节细胞免疫应答的复杂机制。这些发现成功地通过抑制免疫检查点以启动抗肿瘤T细胞应答并引发持久的免疫反应。针对免疫检查点细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)的单克隆抗体已被FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤、肺癌等肿瘤。本研究旨在通过利用规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRSIPR)和CRISPR相关蛋白9(CRISPR-Associated protein 9,Cas9)基因编辑技术删除细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)的免疫检查点CTLA-4,并对其体内外的抗肿瘤作用进行实验研究。本研究第一部分针对CTLA-4设计特异小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)并构建sgRNA/Cas9质粒,质粒使用慢病毒载体转染至CTL,获得删除CTLA-4的CTL细胞(CTLA-4 KO CTL)并验证质粒的转染效率和CTLA-4的删除效率。第二部分实验设计了CTLA-4 KO CTL细胞对靶细胞结肠癌HCT116细胞系的体外杀伤实验及对其凋亡的影响,同时检测了肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)和干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)的分泌量。体外的实验结果为体内实验提供了良好的基础,但是体外和体内环境因素的差异可能对CTLA-4 KO CTL细胞发挥作用造成不同的影响,为此第三部分实验建立了人源化NOD/SCID小鼠模型,模拟肿瘤患者的体内环境,建立结肠癌移植瘤小鼠模型后,给予CTLA-4 KO CTL细胞治疗,观察肿瘤的体积变化及小鼠的生存周期情况以评价其体内抗肿瘤的作用。第一部分构建慢病毒载体CRISPR/Cas9系统转染CTL细胞删除免疫检查点CTLA-4目的:使用CRSIPR/Cas9技术删除CTL细胞的免疫检查点CTLA-4并验证其转染效率和删除效率。方法:针对CTLA-4设计sgRNA序列并构建sgRNA/Cas9质粒,质粒使用慢病毒包装后转染培养的CTL细胞并验证质粒的转染效率和CTLA-4的删除效率。结果:1.设计sg RNA并成功构建以慢病毒为载体的CRSIPR/Cas9系统。2.使用构建好的CRSIPR/Cas9系统转染CTL细胞,转染效率可达(28.80±0.62)%。3.转染后以Western blot及流式细胞术检测CTLA-4的删除效率,CTLA-4 KO CTL组的CTLA-4表达(0.91±0.25)%较CTL组(42.70±2.72)%显著降低(P<0.05)。4.慢病毒的转染方法对T细胞的增殖造成短暂的影响,经过后期细胞因子刺激培养后增殖活性恢复。小结:成功构建慢病毒载体的CRSIPR/Cas9系统,并成功转染CTL细胞,可有效删除CTLA-4基因,使CTLA-4表达显著降低。第二部分删除免疫检查点CTLA-4后CTL细胞的体外抗结肠癌作用研究目的:研究CTLA-4 KO CTL细胞体外抗肿瘤作用。方法:分别将实验组CTLA-4 KO CTL及对照组CTL与结肠癌细胞HCT116共培养后,WST-1法检测两组细胞的体外杀伤活性;流式细胞Annexin V/PI双染法检测肿瘤细胞凋亡;Western Blot检测肿瘤细胞凋亡蛋白表达;凋亡蛋白试剂盒检测肿瘤细胞凋亡蛋白活性;ELISA法检测细胞因子TNF-α、IFN-γ的分泌量。结果:1.CTLA-4 KO CTL组相较于CTL组对结肠癌肿瘤细胞杀伤效率显著提高(P<0.05)。2.CTLA-4 KO CTL相较于CTL对结肠癌肿瘤细胞凋亡率显著提高(P<0.05)。3.CTLA-4 KO CTL相较于CTL可使结肠癌肿瘤细胞的凋亡蛋白表达和凋亡蛋白活性明显增加(P<0.05)。4.CTLA-4 KO CTL相较于CTL其TNF-α、IFN-γ分泌量显著提高(P<0.05)。小结:免疫检查点CTLA-4删除后可提高CTL在体外对结肠癌肿瘤细胞的杀伤和凋亡作用,并促进分泌TNF-α、IFN-γ。第三部分删除免疫检查点CTLA-4后CTL细胞的体内抗结肠癌作用研究目的:研究CTLA-4 KO CTL细胞对结肠癌移植瘤小鼠模型的抗肿瘤作用。方法:采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法构建人源化的NOD/SCID小鼠模型,流式细胞术检测小鼠外周血中人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达情况。人源化的NOD/SCID小鼠构建结肠癌移植瘤动物模型,成瘤后将动物随机分为2组进行实验,分别给予CTLA-4KO CTL(实验组)及CTL(对照组)鼠尾静脉回输细胞治疗,观察肿瘤的生长体积及小鼠的生存时间并检测移植瘤小鼠血清TNF-α及IFN-γ的分泌水平。结果:1.人源化的NOD/SCID小鼠外周血中检测到人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达,表达比率与正常人相似,表明人源化成功。2.CTLA-4 KO CTL组小鼠肿瘤体积较CTL组被显著抑制(P<0.05)。3.CTLA-4 KO CTL组小鼠相较于CTL组生存时间明显延长(P<0.05)。4.与CTL组相比,CTLA-4 KO CTL组移植瘤小鼠血清TNF-α及IFN-γ的分泌水平明显增高(P<0.05)。小结:采用鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法成功构建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并在此基础上制造结肠癌移植瘤模型。CTLA-4 KO CTL可使肿瘤体积明显缩小,明显延长移植瘤小鼠生存周期并显著提高其TNF-α及IFN-γ的分泌水平结论:慢病毒载体CRSIPR/Cas9系统是一种有效的基因编辑手段,成功的在CTL细胞中删除了免疫检查点CTLA-4,CTLA-4 KO CTL可以显著增强CTL对结肠癌的抗肿瘤作用。