背景：　　经皮穿刺冷冻治疗前列腺癌后可诱导机体产生冷冻免疫反应，但冷冻免疫反应强度及持续时间个体间差异较大，如何有效提高冷冻免疫反应强度和持续时间是目前该领域研究的热点。Treg细胞在免疫反应中具有负性调节作用，在冷冻免疫反应中发挥何种作用，如何发挥作用，能否通过免疫佐剂、瘤苗和或其他药物改善Treg功能状态，加强冷冻免疫强度，延长发挥作用时间，从而有效改善患者生存和预后，并为冷冻治疗联合免疫治疗能否成为前列腺癌最佳治疗方式提供理论和实验依据。　　目的：　　1．研究前列腺癌冷冻治疗后，机体抗肿瘤免疫功能状态的改变，以及冷冻后Treg免疫功能状态，探讨冷冻联合免疫佐剂 Anti-CTLA-4Ab对机体免疫功能状态的影响。　　2．通过体外实验明确 CD4+CD25+Foxp3+Treg是否对 Th（辅助性 T细胞）和CTL（细胞毒性T细胞）细胞具有免疫抑制作用以及如何发挥其抑制作用。　　材料与方法：　　1.种植RM-1细胞小鼠前列腺癌移植瘤。　　2.把所有小鼠随机分为GroupA-空白对照组、GroupB-单纯冷冻治疗组、GroupC-冷冻联合Anti-CTLA-4Ab治疗组和GroupD-单纯Anti-CTLA-4Ab治疗组。用直径为2mm冷冻针做冷冻治疗。　　3. HE染色法观察肿瘤引流淋巴结（TDLNs）和肺转移发生率；测量各组各时间点肿瘤大小变化；记录各组小鼠总体生存时间（OS）；免疫组学法检测肿瘤局部、TDLNs中Treg细胞、CD4+Th细胞和CD8+CTL细胞的数量变化；流式法检测肿瘤局部、TDLNs、脾脏中Treg细胞、CD4+Th细胞和CD8+CTL细胞的数量变化；LDH法检测 TDLNs、脾脏中 CD8+CTL细胞杀伤活性；ELISA方法检测外周血细胞因子IL-2、TGF-β1的分泌情况。　　4.用5只Foxp3-GFP(FITC)阳性转基因小鼠，获取脾脏淋巴细胞后，流式细胞分选细胞群CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD4+CD25-T、CD8+T和DC细胞，分组进行共培养，并给予 Anti-CTLA-4Ab治疗后，在24h、48h、72h检测CD4+Th细胞和CD8+CTL细胞凋亡情况，并检测其上清液细胞因子TGF-β1、IFN-γ、IL-4、IL-10分泌情况。　　结果：　　1.对照组（A组）、单纯冷冻组（B组）、联合组（C组）、单纯CTLA-4Ab组（D组）治疗21天后，肿瘤引流淋巴结（TDLNs）转移率分别为100％、80%、60%和80%，肺转移率为100%、80%、60%和80%。　　2.单纯冷冻组（B组）和联合组（C组）控制肿瘤大小生长效应在治疗后14天达高峰（P<0.05），前者治疗21天后，恢复至治疗前的水平（P<0.05），后者有所恢复，但并未达到治疗前的水平。　　3.总体生存分析结果显示，单纯冷冻组（B组）、联合组（C组）与对照组（A组）相比均具有统计学差异（P=0.045，P<0.001）；联合组（C组）与单纯冷冻组（B组）、单纯CTLA-4Ab组（D组）相比均具有统计学差异（P=0.025，P=0.002）。　　4.单纯冷冻组（B组）、联合组（C组）外周血分泌细胞因子 IL-2（pg/ml）于治疗后14天分泌达到高峰，21天后恢复到治疗前水平（P<0.05）；外周血分泌细胞因子TGF-β1（pg/ml）于治疗后14天分泌达最低值，治疗后21天有所上升，但并未恢复到治疗前水平（P<0.05）。　　5.单纯冷冻组（B组）、联合组（C组）肿瘤局部、TDLNs、脾脏中Treg、CTLA-4+T、CD4+Th、CD8+CTL细胞数量，治疗后14天Treg、CTLA-4+T细胞数量降至最低水平(P<0.05)，CD4+Th和CD8+CTL细胞数量上升至最高水平(P<0.05)，21天后，开始向治疗前水平恢复。　　6.单纯冷冻组（B组）、联合组（C组）脾脏和TDLNs CTL对小鼠前列腺癌（RM-1）细胞杀伤活性（效靶比40:1）于治疗后14天达最高峰（P<0.05），治疗后21天有所下降。　　7.肿瘤组织、TDLNs和脾脏Treg数量与外周血TGF-β1分泌情况呈明显正相关（P<0.001）,与外周血IL-2分泌水平呈明显负相关（P<0.001）；与肿瘤组织、TDLNs内CD4+Th、CD8+CTL细胞数量呈显著负相关（P<0.001）。　　8.肿瘤组织、TDLNs以及脾脏Foxp3+Treg/CD8+T细胞比值在单纯冷冻组（B组）治疗后14天及21天无明显变化（P>0.05）；在联合组（C组）治疗后14天下降至最低水平(P<0.05)，治疗后21天有升高趋势（P<0.05）；在单纯CTLA-4Ab组（D组）治疗后14天升高至最高水平，治疗后21天呈下降趋势（P<0.05）。　　9.细胞共培养24h、48h后，Treg细胞可以促进CD4+Th细胞和CD8+CTL细胞凋亡（P<0.05），抑制其细胞因子分泌IFN-γ、IL-4、IL-10（P<0.05），具有抑制Th细胞和CTL细胞的功能。　　10.在抗原提呈细胞存在的情况下，Anti-CTLA-4Ab可以抑制 Treg细胞分泌TGF-β1、IL-10（P<0.05），明显减弱Treg促进CD4+Th细胞和CD8+CTL细胞凋亡的作用（P<0.05），从而发挥抑制Treg细胞免疫抑制功能。　　结论：　　1.冷冻治疗能够有效降低肿瘤和TDLNs内的Treg数量，同时增加Th细胞和CTL细胞的数量。　　2.冷冻治疗联合免疫佐剂Anti-CTLA-4Ab可以有效增强冷冻引起的抗肿瘤免疫反应（ATIR）。　　3.冷冻治疗引起的ATIR具有时间依赖性，治疗后14天达高峰，治疗后21天恢复至治疗前的水平；冷冻治疗联合免疫佐剂Anti-CTLA-4Ab后ATIR在治疗后21天内仍维持较高水平，未见明显时间依赖性。　　4.冷冻治疗通过降低体内及肿瘤局部Treg细胞数量，发挥ATIR；Anti-CTLA-4Ab通过抑制Treg细胞功能，发挥ATIR。　　5. Treg细胞可以促进CD4+Th、CD8+CTL细胞凋亡，抑制CD4+Th、CD8+CTL细胞因子分泌，进而抑制CD4+Th、CD8+CTL细胞发挥有效的抗肿瘤免疫；在抗原提呈细胞存在的情况下，Anti-CTLA-4Ab可以抑制 Treg细胞因子分泌，明显抵抗Treg诱导CD4+Th、CD8+CTL细胞凋亡作用，从而发挥抑制Treg细胞免疫抑制功能。